文昌魚組織蛋白酶D基因的克隆、鑒定及功能研究.pdf

1、組織蛋白酶D(cathepsin D,縮寫CTSD,EC3.4.23.5)是天冬氨酸蛋白酶家族的重要成員,屬于酸性溶酶體內(nèi)切酶,廣泛存在于脊椎動物、真菌、反轉(zhuǎn)錄病毒和一些植物病毒中。CTSD主要是在溶酶體和內(nèi)吞小體中對機體代謝產(chǎn)生的各種蛋白質(zhì)以及抗原進行分解,在脊椎動物免疫過程中起重要作用。文昌魚(amphioxus)是介于無脊椎動物和脊椎動物之間的過渡類型,是現(xiàn)存的與脊椎動物祖先最接近的無脊椎動物,一直被認(rèn)為是研究脊椎動物起源和進化的

2、重要模式動物。免疫系統(tǒng)的起源和進化是最近研究的熱點之一。那么在文昌魚中,CTSD的功能是什么?是否有類似脊椎動物的蛋白裂解功能,能否參與無脊椎動物的先天性免疫反應(yīng)?為了回答上述問題,從青島文昌魚(Branchiostoma japonicus)中克隆具有完整開放閱讀框的組織蛋白酶D基因,并對該基因的結(jié)構(gòu)、進化、表達(dá)和功能進行研究。結(jié)果表明,青島文昌魚中存在一個全長為1772bp的CTSD cDNA,編碼一個395個氨基酸的蛋白質(zhì),預(yù)測分

3、子量為42.92 kDa。序列分析顯示該蛋白與人的組織蛋白酶D同源性達(dá)到57.3％,具有典型的天冬氨酸蛋白酶家族結(jié)構(gòu),在其N-末端存在45氨基酸序列的前肽(1-45位殘基),其中1—16位殘基為信號肽,具有一個完整的Asp結(jié)構(gòu)域,有兩個Asp(Asp-Thr-Gly)活性中心,上述分析表明所得到的基因就是文昌魚的組織蛋白酶D(AmphiCTSD)。用AmphiCTSD和其它物種CTSD的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,發(fā)現(xiàn)AmphiCTSD與

4、無脊椎動物的組織蛋白酶D聚為一支,提示文昌魚AmphiCTSD基因較原始。
　　 其次,對AmphiCTSD基因在青島文昌魚中的表達(dá)情況做了研究。成體的實時定量和切片原位雜交實驗表明,AmphiCTSD在文昌魚的卵、后腸、肝盲囊和皮膚黏膜系統(tǒng)中表達(dá)量較豐富,而在精巢中微弱表達(dá)。胚胎原位雜交結(jié)果表明文昌魚AmphiCTSD在其各個發(fā)育時期均有表達(dá),尤其在細(xì)胞分裂旺盛部位表達(dá)較高,很可能與細(xì)胞分裂有關(guān)。神經(jīng)胚至兩天幼蟲之間,Amph

5、iCTSD在腸道部位表達(dá)豐度較高。用細(xì)菌外毒素(LPS,LTA)處理文昌魚顯示,AmphiCTSD的表達(dá)量分別在經(jīng)上述外毒素誘導(dǎo)后12h和24h其表達(dá)水平至最低,而后逐漸上升。上述結(jié)果表明,AmphiCTSD很可能與免疫反應(yīng)相關(guān)。
　　 為了在蛋白水平上驗證文昌魚的AmphiCTSD是否與免疫相關(guān),構(gòu)建AmphiCTSD原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)表達(dá)。對純化后的重組蛋白AmphiCTSD進行復(fù)性,復(fù)性后的AmphiCTSD