青島文昌魚銅藍(lán)蛋白基因的克隆、表達(dá)和調(diào)控與肝臟的起源.pdf_第1頁(yè)
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1、銅藍(lán)蛋白是一種含銅的α-糖蛋白,廣泛存在于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物體內(nèi)。在肝臟中,新合成的銅藍(lán)蛋白前體在分泌的早期與銅相結(jié)合,伴隨著多糖的修飾形成銅藍(lán)蛋白,進(jìn)一步釋放到血液中。銅藍(lán)蛋白最突出的功能是:(1)結(jié)合血清中的銅(血液中95%的銅與銅藍(lán)蛋白結(jié)合)和(2)通過自身的亞鐵氧化酶活性抑制鐵離子產(chǎn)生自由基,此外,銅藍(lán)蛋白在胚胎及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、新生毛細(xì)血管的形成、自由基的清除等過程中發(fā)揮重要作用。
  銅藍(lán)蛋白是多銅氧化酶家族的重要成

2、員。多銅氧化酶家族是極少數(shù)能氧化底物并將氧分子氧化為兩個(gè)水分子的一類酶。目前已確認(rèn)的多銅氧化酶有三類分別為:銅藍(lán)蛋白、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和胎盤鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。該家族具有亞鐵氧化酶活性,對(duì)鐵具有高度的親和性,能夠有效的將Fe2+氧化為Fe3+,在機(jī)體內(nèi)的鐵代謝方面具有重要意義。銅藍(lán)蛋白通過抑制Fe2+參與Fenton和Haber-Weiss反應(yīng)生成的自由基,減少Fe2+積累所導(dǎo)致的毒性。因此銅藍(lán)蛋白對(duì)體內(nèi)鐵代謝以及和體內(nèi)鐵濃度的調(diào)節(jié)具有十分重要的作

3、用。
  頭索動(dòng)物文昌魚,處于脊索動(dòng)物門的基部,占據(jù)了無脊椎動(dòng)物進(jìn)化到脊椎動(dòng)物的重要節(jié)點(diǎn)。文昌魚成為了研究脊椎動(dòng)物起源與進(jìn)化的重要的模式生物。過去的眾多研究表明,在文昌魚中存在類似于脊椎動(dòng)物肝臟的組織,被稱為肝盲囊。在脊椎動(dòng)物中肝臟是銅藍(lán)蛋白合成的重要器官,同時(shí)在鐵的貯存和解毒方面發(fā)揮著重要作用,銅藍(lán)蛋白在細(xì)胞內(nèi)鐵的代謝和降低Fe2+毒性方面具有重要作用。雖然銅藍(lán)蛋白廣泛分布于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中,但目前大量的研究針對(duì)的僅是脊椎

4、動(dòng)物中的銅藍(lán)蛋白,在無脊椎動(dòng)物當(dāng)中有關(guān)銅藍(lán)蛋白的表達(dá)和調(diào)控的研究則比較有限。
  在本實(shí)驗(yàn)中,首先對(duì)文昌魚中銅藍(lán)蛋白的進(jìn)行了鑒定、進(jìn)化分析與組織表達(dá)研究。文昌魚銅藍(lán)蛋白的cDNA的開放閱讀框(ORF)是3534 bp,開放閱讀框編碼1178個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),成熟蛋白的分子質(zhì)量約為130.85 kDa,等電點(diǎn)(PI)為4.83。該蛋白質(zhì)屬于多銅氧化酶家族,具有該家族特有的Cu-oxidase結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)此預(yù)測(cè)的蛋白序

5、列與脊椎動(dòng)物的銅藍(lán)蛋白具有42.7%到46.1%的相似性,與無脊椎動(dòng)物有20.7%到49.7%的相似性。雖然文昌魚的序列與人的序列相似性只有45.8%,但是它們的3D結(jié)構(gòu)卻具有驚人的相似性,這說明了文昌魚銅藍(lán)蛋白與人的功能可能也具有一定的相似性。我們通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶反應(yīng)檢測(cè)到它在文昌魚各個(gè)組織中均有表達(dá),在肝盲囊表達(dá)量最高,具有組織特異性表達(dá)的特點(diǎn)。此外,在文昌魚經(jīng)過鐵離子或脂多糖處理后,銅藍(lán)蛋白的表達(dá)量均會(huì)有不同程度的上調(diào)。這些

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