文昌魚Frizzled家族和Pygopus基因的鑒定克隆及其在早期胚胎中的表達(dá)與功能分析.pdf

1、Wnt信號(hào)通路是進(jìn)化上一條十分保守的信號(hào)通路。目前，人們發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路參與后生動(dòng)物體軸決定和各類器官的形態(tài)建成與發(fā)育，并且其關(guān)鍵成員在不同類群中均具有一定的同源性。盡管先前人們對(duì)Wnt信號(hào)通路及其相關(guān)基因在胚胎發(fā)育、器官形成與疾病調(diào)控中已有很多深入的研究報(bào)道，但這些數(shù)據(jù)主要來自果蠅、小鼠和人類等少數(shù)物種中，在其它物種中研究相對(duì)較少。近年來，文昌魚Wnt信號(hào)通路若干發(fā)育關(guān)鍵基因已陸續(xù)有報(bào)道并揭示出這些成員在早期胚胎發(fā)育中的功能演化，例

2、如此前報(bào)道的8個(gè)Wnt基因、β-catenin、Tcf(T cell factor)以及Dkk和Axin基因家族等。但與其它模式動(dòng)物相比，文昌魚Wnt信號(hào)通路與早期胚胎發(fā)育的功能研究可以說才剛剛起步，很多發(fā)育關(guān)鍵基因的功能仍有待揭示。
　　 本文首先通過對(duì)白氏文昌魚（Branchiostoma belcheri）基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源搜索分析，鑒定并克隆了Wnt信號(hào)通路Frizzled(Fz)基因家族所有4個(gè)成員以及下游細(xì)

3、胞核中Pygopus（Pygo）基因，通過進(jìn)化分析、時(shí)空表達(dá)譜研究，發(fā)現(xiàn)1）文昌魚基因組中僅含有4個(gè)Fz基因，即AmphiFz1/2/7、AmphiFz4、AmphiFz5/8和AmphiFz9/10。由于之前報(bào)道佛羅里達(dá)文昌魚基因組中含有5個(gè)Fz基因，重新對(duì)以上各成員進(jìn)行預(yù)測、序列比對(duì)及基因組共線性分析，澄清了文昌魚Fz基因的個(gè)數(shù)。系統(tǒng)進(jìn)化樹把后口動(dòng)物Fz基因家族劃分為5個(gè)亞家族，而Fz3/6亞家族成員可能是在尾索動(dòng)物和脊椎動(dòng)物共同祖

4、先中首次分化后產(chǎn)生的，因?yàn)樗⑽丛谖牟~和其它除尾索動(dòng)物以外的無脊椎動(dòng)物類群中有發(fā)現(xiàn)。2）白氏文昌魚4個(gè)Fz基因均為母源性表達(dá)，而在檢測的10個(gè)Wnt基因中，僅AmphiWnt6、AmphiWnt1和AmphiWnt9～AmphiWnt11顯示微弱母源性表達(dá)量，提示它們可能參與了早期動(dòng)植物極的建立。其次，不同Wnt基因和Fz基因啟動(dòng)合子型表達(dá)的時(shí)間也并不一致，但是所有AmphiFz和AmphiWnt（AmphiWnt5～AmphiWnt

5、7除外）基因在原腸胚中期的表達(dá)量均達(dá)到最大值，這進(jìn)一步提示W(wǎng)nt信號(hào)在早期胚軸建立以及原腸運(yùn)動(dòng)和三胚層的形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。3）空間表達(dá)譜顯示4個(gè)AmphiFz基因在4細(xì)胞及囊胚晚期均廣泛表達(dá)。但從原腸胚中期開始，表達(dá)區(qū)域開始出現(xiàn)分化，AmphiFz1/2/7在中間背部的神經(jīng)板、體節(jié)中胚層、哈氏窩(Hatschek's pit)以及口部周圍表達(dá);AmphiFz4在神經(jīng)外胚層、中胚層、咽鰓裂內(nèi)胚層和整個(gè)腸道區(qū)域表達(dá);AmphiFz5/8

6、基因一直在最前端區(qū)域表達(dá)，而AmphiFz9/10基因在神經(jīng)板、后端體節(jié)以及尾牙部位表達(dá)。這種動(dòng)態(tài)、多樣性的表達(dá)方式提示文昌魚Fz基因家族與已報(bào)道的脊椎動(dòng)物多個(gè)直系同源基因類似，主要參與早期胚軸的建立、體節(jié)以及神經(jīng)系統(tǒng)和多種器官的形態(tài)建成與發(fā)育。
　　 此外，克隆獲得白氏文昌魚Wnt信號(hào)通路下游細(xì)胞核中一個(gè)Pygo基因及其在斑馬魚中兩個(gè)直系同源基因DrPygo1和DrPygo2。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)已測序的鳥類基因組中僅含有Pygo

7、1;而在除斑馬魚以外已測序的硬骨魚基因組中僅含有Pygo2。實(shí)時(shí)表達(dá)譜揭示這3個(gè)Pygo基因均為母源性表達(dá)，且文昌魚Pygo基因合子表達(dá)區(qū)域主要集中在咽鰓裂區(qū)。原位雜交并未檢測到斑馬魚DrPygo1基因在早期胚胎中表達(dá)，相反，DrPygo2基因在早期胚胎中廣泛表達(dá)，后期表達(dá)信號(hào)則集中在神經(jīng)系統(tǒng)。利用嗎啉環(huán)（Morpholino）反義寡核苷酸敲低DrPygo2基因表達(dá)后還會(huì)導(dǎo)致斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)和眼原基處細(xì)胞的凋亡，后腹部發(fā)育缺陷以及心臟