斑馬魚補(bǔ)體因子Properdin基因的表達(dá)和功能研究.pdf

1、補(bǔ)體是先天性免疫的主要成分，它們通過多種途徑來保衛(wèi)宿主免受感染，比如參與免疫細(xì)胞激活、趨化作用、調(diào)理作用、裂解抗原等。補(bǔ)體系統(tǒng)可以被三種途徑激活，即經(jīng)典途徑、替補(bǔ)途徑和凝集素途徑。補(bǔ)體因子 Properdin又稱為 P因子，它由Pillemer等在1954年被首次描述，它是現(xiàn)在已知的唯一一個(gè)補(bǔ)體系統(tǒng)的正調(diào)控因子。P因子可以和C3轉(zhuǎn)化酶結(jié)合以增加它的穩(wěn)定性，C3轉(zhuǎn)化酶由激活的C3b和B因子裂解形成的片段Bb形成。P因子由六個(gè)典型的TSR模

2、塊和一個(gè)縮短的TSR結(jié)構(gòu)域TSR0組成。目前關(guān)于P因子的認(rèn)識主要來源于哺乳類，而在低等脊椎動(dòng)物如魚類中關(guān)于P因子的研究還很有限。另外，P因子的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的信息也相當(dāng)不完整。斑馬魚是一種被廣泛應(yīng)用的模式生物，但是關(guān)于P因子在這種重要的模式生物中的信息所知甚少。因此，這篇研究的目的是分析斑馬魚P因子的表達(dá)模式并檢測它的功能及其與結(jié)構(gòu)的關(guān)系。
　　首先，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明斑馬魚P因子的ORF長1314 bp，編碼437個(gè)氨基酸，

3、包括一個(gè)信號肽、六個(gè)依次編號的TSP結(jié)構(gòu)域TSR1-6和一個(gè)被刪剪的TSR0。和人的P因子一樣，斑馬魚的P因子有11個(gè)外顯子和10內(nèi)含子組成，它的TSR0-5由單一的外顯子編碼，而TSR6由兩個(gè)外顯子編碼。多序列比對顯示斑馬魚 P因子的很多氨基酸是高度保守的，而且 TSR4的CSVTCG模體和TSR1-6的WXXWXXW和RXR模體在斑馬魚P因子中也是高度保守的。進(jìn)化樹是利用所選物種 P因子的氨基酸序列全長構(gòu)建的，結(jié)果顯示斑馬魚 P因子

4、和魚類的聚為一簇并且在有頜類的基部，這很好的反應(yīng)了所選生物之間的種系發(fā)生關(guān)系。
　　然后，分別利用RT-PCR技術(shù)和胚胎整體原位雜交檢測了斑馬魚P因子在早期發(fā)育不同時(shí)期和成魚不同組織中的組織和時(shí)期特異性表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果表明斑馬魚 P因子在成魚所有組織中均被檢測到有表達(dá)，且在肝臟中表達(dá)量最高。qRT-PCR結(jié)果還表明P因子的轉(zhuǎn)錄物的豐度在1 hpf時(shí)最高，然后隨時(shí)間急劇下降，從10 hpf開始又逐漸升高直到10 dpf。整體

5、原位雜交的結(jié)果表明在P因子在卵裂期和囊胚期表現(xiàn)為母源性表達(dá)，在原腸期和體節(jié)期表現(xiàn)為泛表達(dá)，隨后在腦、神經(jīng)板、發(fā)育的晶狀體和中性粒細(xì)胞中表達(dá)。
　　最后，我們利用原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了表達(dá)載體并純化出了斑馬魚 P因子的TSR結(jié)構(gòu)域的重組蛋白并做了體外功能試驗(yàn)，證明重組TSRs蛋白可以與C3b、LPS、LTA、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌結(jié)合。另外，我們探索了這些重組蛋白對吞噬作用的影響，結(jié)果表明，只有TSR5結(jié)構(gòu)域可以促進(jìn)吞噬細(xì)胞對細(xì)菌的