斑馬魚翻譯延伸因子EF-2的克隆、表達(dá)譜分析及功能研究.pdf

1、翻譯延伸因子2(EF-2)，催化了蛋白質(zhì)合成過程中的核糖體的移動(dòng)，使肽基-tRNA從核糖體的A位點(diǎn)移動(dòng)到P位點(diǎn)，從而釋放出A位點(diǎn)以接收一個(gè)新的三重復(fù)合物(EFl)。 關(guān)于EF-2，目前所知的只有磷酸化以及ADP-核糖基化等修飾調(diào)控作用，而與發(fā)育調(diào)控相關(guān)的EF-2至今還鮮有報(bào)道。斑馬魚胚胎發(fā)育過程中EF-2基因還從未有人報(bào)道過，因此，克隆并通過整胚原位雜交分析了斑馬魚EF-2基因的表達(dá)模式。 通過大規(guī)模cDNA測序，斑馬魚

2、EF-2全長eDNA從成魚腎臟eDNA文庫中克隆得到。斑馬魚EF-2基因全長2826bp，其開放閱讀框跨越從第55個(gè)核苷酸到第2631個(gè)核苷酸，編碼了一個(gè)長858個(gè)氨基酸、分子量為95．5kD的蛋白質(zhì)。斑馬魚EF-2蛋白高度保守，與人、小鼠、中國倉鼠以及Gallus的EF-2蛋白存在著分別為92％、93％、93％和92％序列一致性。通過對斑馬魚EF-2所編碼的858個(gè)氨基酸的分析表明它含有16個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。與其它EF-2蛋白一樣，斑馬魚

3、EF-2蛋白的GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于氨基末端，ADP-核糖基化作用結(jié)構(gòu)域則位于羰基末端。 原位雜交結(jié)果顯示EF-2轉(zhuǎn)錄物在胚胎發(fā)育的早期就大量出現(xiàn)，并且在5體節(jié)期表現(xiàn)為全身都有強(qiáng)烈的表達(dá)。隨著胚胎的發(fā)育，其表達(dá)逐漸特異。從22體節(jié)期開始，體節(jié)(肌肉組織)上的表達(dá)逐漸清晰。隨后，表達(dá)大多集中在眼睛、腦部以及體節(jié)。在prim-15時(shí)期，染色的細(xì)胞主要集中在晶體、視網(wǎng)膜、中腦、小腦，而且身體后端的體節(jié)表達(dá)特別明顯。但是從prim-25時(shí)

4、期開始，EF-2表達(dá)只出現(xiàn)在晶體以及小腦的前部。 整胚原位雜交結(jié)果顯示斑馬魚EF-2基因可能是個(gè)受發(fā)育調(diào)控的基因，并且在斑馬魚胚胎的早期發(fā)育過程中起到了非常重要的作用，因此進(jìn)一步研究了EF-2的功能。在本論文中，采用了過量表達(dá)和反義技術(shù)這兩種方法，來研究EF-2在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的作用。將表達(dá)載體pcDNA3-EF2以及體外轉(zhuǎn)錄的EF-2mRNA注射到斑馬魚胚胎中，沒有觀察到畸形現(xiàn)象，表明EF-2的過量表達(dá)對斑馬魚胚胎的發(fā)育