青石斑魚B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)及斑馬魚TNFSF14的克隆、表達(dá)及生物學(xué)功能研究.pdf

1、B淋巴細(xì)胞刺激因子(BAFF)和T細(xì)胞上可誘導(dǎo)表達(dá)的、與HSV的糖蛋白D競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HVEM的淋巴毒素類似物(LIGHT)都是TNF超家族的重要成員。BAFF廣泛參與B淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化，LIGHT能夠刺激T淋巴細(xì)胞的增生、誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡等功能，二者在淋巴器官的發(fā)生、自身免疫病、抗病毒免疫等均發(fā)揮重要作用。到目前為止，對(duì)于石斑魚BAFF基因和斑馬魚LIGHT基因的研究在國(guó)內(nèi)外還處于空白狀態(tài)。
　　1、青石斑魚B淋巴細(xì)胞

2、刺激因子的克隆、表達(dá)及其生物活性的研究。
　　本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR和RACE技術(shù)，從青石斑魚脾臟組織中擴(kuò)增得到B淋巴細(xì)胞因子(EaBAFF)的全長(zhǎng)eDNA序列，該基因全長(zhǎng)1442bp，包括5'和3'端非編碼區(qū)以及780 bp的開放閱讀框（編碼259個(gè)氨基酸）。與其它物種已知BAFF特征相同，EaBAFF的氨基酸序列也含有一個(gè)預(yù)測(cè)跨膜區(qū)、潛在的弗林酶切位點(diǎn)、三個(gè)半胱氨酸殘基、一個(gè)典型的TNF結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)與人的三維結(jié)構(gòu)極其

3、相似。實(shí)時(shí)定量PCR表明EaBAFF主要表達(dá)在青石斑魚脾臟中。pET28a-EasBAFF質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)了His6-EasBAFF融合蛋白，對(duì)鎳柱純化得到的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和western blot分析鑒定。激光共聚焦結(jié)果顯示該蛋白可以與青石斑魚和小鼠的淋巴細(xì)胞表面的受體結(jié)合，體外WST-8檢測(cè)表明His6-EasBAFF能夠促進(jìn)青石斑魚淋巴細(xì)胞和小鼠B淋巴細(xì)胞的存活。我們的研究結(jié)果或許能夠?yàn)榍嗍?/p>

4、斑魚免疫系統(tǒng)的研究提供理論依據(jù)，EasBAFF有可能作為免疫增強(qiáng)劑增強(qiáng)魚體抵抗力。
　　2、斑馬魚LIGHT的克隆、表達(dá)及活性分析。
　　應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從斑馬魚脾臟組織中擴(kuò)增的到LIGHT的全長(zhǎng)CDS序列，zLIGHT的開放閱讀框?yàn)?08bp，編碼235個(gè)氨基酸。zLIGHT含有預(yù)測(cè)跨膜區(qū)以及典型的胞外TNF結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)定量PCR表明zLIGHT主要表達(dá)在斑馬魚脾臟和腎臟，pSUMO-zsLIGHT質(zhì)粒能夠在大腸桿菌