重組人可溶性B淋巴細(xì)胞刺激因子的制備及功能鑒定.pdf

1、我們進(jìn)行了人BLyS胞外區(qū)cDNA的克隆,重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建,重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的鑒定,旨在為進(jìn)一步研究和開發(fā)用于治療自身免疫性疾病和免疫功能低下疾病的BLyS相關(guān)制劑奠定基礎(chǔ).該項(xiàng)研究取得的主要結(jié)果如下:1.經(jīng)RT-PCR成功地克隆了編碼人BLyS胞外區(qū)78-285和112-285的cDNA,經(jīng)查對與GenBank上登錄的編碼相應(yīng)BLyS胞外區(qū)cDNA的序列完全一致.兩序列被GenBank登錄,登錄號分別為AY129

2、226、AY129227.2.將測序正確的目的片段分別插入原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L,成功地構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pQE-80L/BLyS78和pQE-80L/BLyS112.3.上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,經(jīng)IPTG誘導(dǎo),均獲得了較高水平的表達(dá),并確立BLyS在大腸桿菌中高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為終濃度1mmol/L的IPTG在37℃誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí).SDS-PAGE分析可見,表達(dá)蛋白的大小分別約為26kDa和21kDa,主要是

3、以包涵體的形式存在.Western blot分析顯示,分別在分子量26kDa和21kDa處出現(xiàn)單一條帶,而對照的菌體則無此反應(yīng).4.經(jīng)Ni<'2+>-NTA純化系統(tǒng)及尿素分步透析,表達(dá)蛋白得到了有效純化和復(fù)性.純化蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶,復(fù)性蛋白經(jīng)Sephadex G75柱分析顯示,以單體和三聚體兩種形式存在.5.生物學(xué)活性分析顯示,所制備的重組可溶性BLyS78-285和112-285不僅可刺激人外周血淋巴細(xì)胞增殖,而且