重組人可溶性TRAIL的制備及其聯(lián)合硼替佐米誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、目的：人工合成人腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)胞外功能區(qū)的基因序列,構(gòu)建其重組原核表達質(zhì)粒,優(yōu)化蛋白表達和純化的相關(guān)條件,制備具有生物活性的重組人可溶性TRAIL并研究其聯(lián)合蛋白酶體抑制劑硼替佐米(萬珂)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用及其機制。
　　方法：通過PCR技術(shù)擴增TRAIL胞外功能區(qū)第114-281個氨基酸基因序列,利用基因重組技術(shù)構(gòu)建原核

2、表達質(zhì)粒pET-28a(+)-TRAIL114-281。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli DH5α中,通過酶切鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子并送上海英駿公司測序。從DH5α-pET-28a(+)-TRAIL114-281中提取出經(jīng)測序驗證過的重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中,誘導(dǎo)表達蛋白時調(diào)整誘導(dǎo)前菌群的密度(OD600值)、IPTG濃度、溫度及誘導(dǎo)時間選擇最佳誘導(dǎo)條件,同時對超聲、滲透沖擊和細(xì)胞裂解液三種破碎細(xì)菌方法做比較。并在低溫

3、誘導(dǎo)時,加IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達的同時加入了1mMZnSO4優(yōu)化表達條件。親和層析法純化可溶性TRAIL蛋白后以不同濃度分別作用于H460細(xì)胞(對TRAIL敏感)和K562細(xì)胞(對TRAIL抵抗)24h,使用CCK-8法驗證TRAIL是否具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的生物活性。將制備的TRAIL單獨或聯(lián)合50nM硼替佐米應(yīng)用于H460和K562細(xì)胞,Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,比色法檢測caspase-8/

4、-9/-3的活化程度,western blot分析細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cFLIP蛋白的表達。流式細(xì)胞術(shù)檢測50nM硼替佐米處理H460和K562細(xì)胞24h后DR4、DR5的表達量變化。
　　結(jié)果：
　　1.PCR擴增基因后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)500bp附近有一條明顯的擴增條帶,與TRAIL預(yù)期目的片段524bp大小一致,重組質(zhì)粒pET-28a(+)-TRAIL114-281經(jīng)雙酶切并瓊脂糖凝膠電泳分

5、析,可見切下載體片段5344bp和目的片段524bp,這證實了TRAIL基因被成功擴增并正確連接至載體上。
　　2.將誘導(dǎo)蛋白表達產(chǎn)物的沉淀和上清進行SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)在蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)約為24KDa處沉淀和上清中均有明顯蛋白條帶,與預(yù)期的TRAIL蛋白分子量大小相符,證明了沉淀和上清中均有TRAIL蛋白表達,TRAIL蛋白誘導(dǎo)表達成功。
　　3.親和層析法純化可溶性蛋白后行SDS-PAGE分析,發(fā)現(xiàn)只在24KDa處有

6、單一條帶而無其他雜條帶,說明TRAIL純化效果良好。
　　4.0、50、100、200、400、800ng/mlTRAIL作用于細(xì)胞24h后CCK-8法檢測其細(xì)胞活性,H460的細(xì)胞活性分別為100％,82.30±21.68%,78.73±19.12%,53.49±8.79%,47.42±7.34%,46.68±3.05%;K562的細(xì)胞活性分別為100%,87.12±6.12%,83.53±5.96%,78.54±1.34%,7

7、3.33±1.72%,58.29±1.94%,可見隨著TRAIL濃度的升高,細(xì)胞活性逐漸下降。
　　5.0、50、100、200、400、800ng/mlTRAIL作用于細(xì)胞24h后,H460細(xì)胞的凋亡率分別為0.90±0.12%,34.65±5.13%,56.8±7.39%,58.58±7.03%,62.2±9.89%,63.1±8.47%,K562細(xì)胞的凋亡率分別為3.29±0.42%,4.07±1.38%,3.93±0.59

8、%,4.52±1.84%,4.08±2.21%,4.61±0.94%,可見隨著TRAIL濃度的升高,H460細(xì)胞凋亡率也逐漸升高。
　　6.經(jīng)過不同處理,陰性對照(A組)、200ng/mlTRAIL(B組)、50nM硼替佐米(C組)、200ng/mlTRAIL+50nM硼替佐米(D組)分別作用于H460和K562細(xì)胞24h后,凋亡率分別為0.90.±0.12%,58.58±7.03%,13.68±5.92%,85.5±8.38%和

9、3.29±0.42%,4.52±1.84%,3.94±1.47%,7.56±2.44%。經(jīng)過以上不同處理后H460細(xì)胞caspase-8的活化程度分別為1,1.40±0.04,1.20±0.16,1.77±0.32;caspase-9的活化程度分別為1,1.50±0.25,1.45±0.17,2.36±0.20;caspase-3的活化程度分別為1,1.05±0.88,0.90±0.64,2.25±0.80。K562細(xì)胞的caspase

10、-8的活化程度分別為1,1.79±0.59,1.24±0.13,1.72±0.87;caspase-9的活化程度分別為1,1.47±0.26,0.90±0.30,2.38±0.70;caspase-3的活化程度分別為1,1.57±0.06,0.99±0.33,1.96±0.41。聯(lián)合用藥后H460細(xì)胞的Bcl-2表達量由0.60±0.24減少至0.31±0.13,K562細(xì)胞的Bcl-2表達量由0.77±0.46減少至0.37±0.31

11、,H460細(xì)胞的cFLIP表達量由0.95±0.4減少至0.47±0.21,K562細(xì)胞的cFLIP表達量由0.58±0.21減少至0.42±0.08。可見藥物處理后細(xì)胞的caspase均被活化,Bcl-2和cFLIP蛋白表達量下降。
　　7.50nM硼替佐米處理后,H460細(xì)胞DR4表達量由4.19±1.85%上升至11.67±6.81%,DR5的表達量由96.99±1.64%上升至98.43±0.40%;K562細(xì)胞的DR4表

12、達量由0.76±0.44%上升至1.70±0.46%,DR5表達量由20.90±16.97%上升至35.06±14.88%。
　　結(jié)論：
　　1.通過PCR、酶切、連接成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-TRAIL114-281。
　　2.通過條件的優(yōu)化成功制備了具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡生物活性且性質(zhì)穩(wěn)定的重組人可溶性TRAIL。
　　3.TRAIL誘導(dǎo)H460細(xì)胞凋亡具有濃度依賴性,凋亡率隨著TRAIL濃度