柔紅霉素聯(lián)合硼替佐米對(duì)Raji細(xì)胞增殖、凋亡及bax基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的:泛素-蛋白酶體通路(UPP)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的重要途徑之一,參與細(xì)胞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和降解、基因表達(dá)調(diào)控、受體胞吞、應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等多種生理過程。硼替佐米為一種人工合成的硼酸肽類蛋白酶體抑制劑,其通過抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解,從而抑制NF-кB通路,促進(jìn)P53和Bax蛋白的表達(dá),促進(jìn)P21、P27蛋白的蓄積,最終引起細(xì)胞凋亡。Bax蛋白是Bcl-2家族中一種重要的促凋亡蛋白。Bax蛋白通過BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2蛋白結(jié)合

2、,而抑制其抗凋亡活性,同時(shí)Bax蛋白還可移位并插入到線粒體膜中,形成bax通道,從而促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放入胞質(zhì),而誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)是研究硼替佐米聯(lián)合一種常用的葸環(huán)類抗腫瘤藥物柔紅霉素,對(duì)人Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞的增殖、凋亡及bax基因表達(dá)的影響。為其臨床治療Burkia淋巴瘤提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。
　　 方法:
　　 1.藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率:以臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算柔紅霉素(濃度為0.1μg／m

3、l、0.3μg／ml、O.5μg／ml、0.8μg／ml、1.0μg／ml)和硼替佐米(濃度為10ng／ml、50ng／ml、100nng／ml、300ng／ml、500nng／m1)對(duì)Raji細(xì)胞12h、24h、36h、48h、60h的增殖抑制率。對(duì)照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯(lián)合硼替佐米IC25組對(duì)Raji細(xì)胞12h、24h、36h、48h的抑制率。
　　 2.RT-PCR法檢測(cè)bax mR

4、NA的表達(dá):對(duì)照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯(lián)合硼替佐米IC25組對(duì)Raji細(xì)胞作用48h后RT—PCR法測(cè)定bax mRNA表達(dá)的變化。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定Bax蛋白表達(dá):對(duì)照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯(lián)合硼替佐米ICE5組對(duì)Raji細(xì)胞作用48h后免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)的變化。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)Annexin V／PI標(biāo)記

5、法測(cè)定凋亡:對(duì)照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯(lián)合硼替佐米IC25組對(duì)Raji細(xì)胞作用48h后流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞的凋亡情況。
　　 5.統(tǒng)計(jì)分析:所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,對(duì)計(jì)量資料,各組之間應(yīng)用方差齊性檢驗(yàn)和LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn),各數(shù)據(jù)表達(dá)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。以α=0.01或α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P<0.01或P<0.05為差異有顯著性。
　　

6、 結(jié)果:
　　 1.臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)出濃度為0.1μg／ml、0.3μg／ml、0.5μg／ml、0.8μg／ml、1.0μg／ml的柔紅霉素對(duì)Raji細(xì)胞48h的抑制率分別為(38.72±1.87)％,(48.64±1.65)％,(56.87±2.60)％,(66.38±2.55)％,(75.61±2.59)％,IC50=0.36μg／ml,IC25=0.06μg／ml。各濃度組均之間具有顯著性差異。濃度為10ng／ml、5

7、0ng／ml、100ng／ml、300ng／ml、500ng／ml的硼替佐米對(duì)Raji細(xì)胞48h的抑制率分別為(5.62±1.86)％,(20.23±0.97)％,(29.01±1.78)％,(72.65±2.45)％,(86.42±2.18)％,IC50=23.6ng／ml,IC25=8.5 ng／ml。各濃度組均之間具有顯著性差異。對(duì)照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯(lián)合硼替佐米IC25組對(duì)gaji細(xì)胞4

8、8h增殖抑制率為(2.02±1.06)％,(48.63±2.13)％,(52.32±1.66)％,(76.87±2.67)％,加藥組與對(duì)照組均有顯著性差異,聯(lián)合用藥組與兩個(gè)單藥組之間均有顯著差異。
　　 2.對(duì)照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯(lián)合硼替佐米IC25組對(duì)Raji細(xì)胞作用48h后,bax mRNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后電泳DNA條帶灰度值比值分別為0.554±0.012,0.738+0.02

9、3,1.138±0.064,2.384±0.096,各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.對(duì)照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯(lián)合硼替佐米IC25組對(duì)Raji細(xì)胞作用48h后,Bax蛋白經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色后,陽性率分別為7.68±1.65、66.54±1.79、72.39±1.95、96.57±2.28,積分分別為12.71±5.74、76.97±25.12、106.78±31.64、172.07±38

10、.54,各組之間陽性率和積分均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)Annexin V／PI標(biāo)記法測(cè)定對(duì)照組、柔紅霉素IC50組、硼替佐米IC50組、柔紅霉素IC25聯(lián)合硼替佐米IC25組對(duì)Raji細(xì)胞作用48h后,各組凋亡率分別為(1.23±0.29)％,(38.52±4.23)％,(67.37±3.62)％,(81.63±5.19)％,各組之間均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.柔紅霉素和硼替佐米能夠抑