白血病骨髓基質(zhì)細胞對柔紅霉素作用下Jurkat細胞凋亡及基因表達的影響.pdf

1、背景與目的：白血病細胞是惡性克隆性增殖的造血細胞，其生存、分化、增殖均與骨髓基質(zhì)細胞密切相關(guān)。已有研究表明，骨髓基質(zhì)細胞與白血病細胞共培養(yǎng)時，前者能保護白血病細胞逃避化療藥物殺傷，且骨髓基質(zhì)細胞對白血病細胞的保護作用有賴于兩種細胞直接接觸和細胞因子網(wǎng)絡(luò)的形成。大多數(shù)學者認為，抑制白血病細胞增殖、凋亡是骨髓基質(zhì)細胞促進白血病細胞逃避化療藥物殺傷的重要途徑。但上述結(jié)論主要來源于正常骨髓基質(zhì)細胞和骨髓基質(zhì)細胞株的相關(guān)研究。而白血病患者骨髓造血

2、實質(zhì)細胞惡性克隆性增生時伴隨有骨髓基質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)、功能的變化。我室前期研究發(fā)現(xiàn)，白血病骨髓基質(zhì)細胞存在粘附功能、細胞因子分泌、細胞外基質(zhì)成分的異常。白血病骨髓基質(zhì)細胞異常分泌的細胞因子對白血病細胞的作用非常復雜，可以是支持或抑制，協(xié)同或拮抗，還可以被逐級放大，形成復雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)。但白血病患者骨髓基質(zhì)細胞與白血病細胞共培養(yǎng)后可誘導白血病細胞異常表達哪些細胞因子?這些細胞因子對白血病細胞影響如何?這些情況目前未見系統(tǒng)研究報道。白血病細胞與

3、骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)后，白血病細胞能夠逃避化療藥物的殺傷，說明白血病細胞的表型發(fā)生了改變，而細胞表型的改變由基因表達變化決定。因此，克隆白血病骨髓基質(zhì)細胞保護的白血病細胞差異表達基因?qū)τ陉U明骨髓基質(zhì)細胞保護白血病細胞逃避化療藥物殺傷的分子機理有重要意義。本課題在體外分離培養(yǎng)正常人、初治急性白血病患者骨髓原代基質(zhì)細胞，對比研究了它們對人急性淋巴細胞白血病細胞株Jurkat細胞對抗化療藥物-柔紅霉素(DNR)殺傷作用的影響及其可能機制；在此基

4、礎(chǔ)上應用抑制消減雜交等現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，著重研究了白血病骨髓基質(zhì)細胞抑制DNR誘導Jurkat細胞凋亡過程中Jurkat細胞相關(guān)基因表達的變化，并進一步分析了差異表達基因在骨髓基質(zhì)細胞對Jurkat細胞保護過程中的意義。CRIF1(CR6-interactingfactor1)是實驗中Jurkat細胞表達上調(diào)基因之一，是一種新近發(fā)現(xiàn)的細胞周期負調(diào)控因子。而CRIF1與白血病細胞周期調(diào)控的關(guān)系如何?目前未見文獻報道。本課題進一步研究了與

5、白血病骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)后，Jurkat細胞CRIF1及其級聯(lián)基因Gadd45的表達水平變化，并探討它們與Jurkat細胞G0/G1期阻滯的關(guān)系。 方法：①采用Percoll體外分離正常人、初治急性白血病患者骨髓單個核細胞，貼壁培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞；②應用DNR體外作用于Jurkat細胞，研究DNR誘導Jurkat細胞凋亡的規(guī)律，AnnexinV/PI雙標法流式細胞儀檢測Jurkat細胞凋亡率，PI染色流式細胞儀檢測細胞周期分布；③

6、應用掃描電鏡初步觀察了共培養(yǎng)條件下骨髓基質(zhì)細胞與Jurkat細胞的位相特征；④Jurkat細胞分別與正常骨髓基質(zhì)細胞、白血病骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)，研究正常骨髓基質(zhì)細胞、白血病患者骨髓基質(zhì)細胞對Jurkat細胞對抗DNR殺傷作用的影響及其可能機制；⑤采用抑制性消減雜交技術(shù)等分子生物學方法建立白血病骨髓基質(zhì)細胞保護的Jurkat細胞差異表達基因的cDNA文庫；并對差異表達的基因進行初步鑒定與分析；⑥應用RT-PCR技術(shù)檢測了白血病骨髓基質(zhì)細胞

7、保護的Jurkat細胞CRIF1及其級聯(lián)基因Gadd45的mRNA表達的改變。 結(jié)果：①0.1～2.0μmol/L濃度范圍DNR作用一定時間后，Jurkat細胞的凋亡率隨藥物濃度的增加與作用時間的延長而升高。②骨髓基質(zhì)細胞與Jurkat細胞共培養(yǎng)時，Jurkat細胞與骨髓基質(zhì)細胞粘附生長，共培養(yǎng)24hrs時，掃描電鏡下可見部分細胞嵌入骨髓基質(zhì)細胞層。③正常骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)組與單獨懸浮培養(yǎng)組比較，DNR誘導的Jurkat細胞凋亡

8、率有顯著降低(P＜0.005)，白血病骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)組Jurkat細胞凋亡率進一步下降；④DNR處理后，兩共培養(yǎng)組Jurkat細胞G0/G1期比例高于懸浮培養(yǎng)組；而兩共培養(yǎng)組之間無明顯差異。⑤成功地建立了白血病骨髓基質(zhì)細胞保護的Jurkat細胞上調(diào)和下調(diào)差異表達基因的cDNA文庫；經(jīng)反向Northern雜交，初步篩選克隆到30個上調(diào)差異表達基因和22個下調(diào)差異表達基因cDNA片段；并進行了測序和同源性分析，52個差異表達克隆在Gen

9、Bank基因序列數(shù)據(jù)庫中均可找到同源性在86％以上的序列，屬已知基因。但它們中多數(shù)尚無相關(guān)深入的功能研究報道。在30個上調(diào)表達克隆中，功能上較肯定的基因有：組蛋白(histone1，H2a)、細胞色素C氧化酶V亞基(cytochromecoxidasesubunitVb，COX5B)、CRIF1(CR6interactingfactor1)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞單位1(NADHdehy

10、drogenase1)、核糖體蛋白大亞基18a(RibosomalproteinL18a)；下調(diào)表達克隆中，功能上較肯定的基因有核糖體蛋白小亞基11(RibosomalproteinS11)。這些基因功能主要與細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、細胞能量代謝相關(guān)。⑥本研究發(fā)現(xiàn)Jurkat細胞CRIF1mRNA有一定量的基礎(chǔ)表達，與白血病骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)后，Jurkat細胞CRIF1mRNA的表達與對照組相比顯著上調(diào)，同時伴有其級聯(lián)基因Gadd45

11、mRNA的表達上調(diào)。 結(jié)論：一定濃度的DNR在體外可誘導Jurkat細胞凋亡，在一定的劑量范圍內(nèi)隨濃度、作用時間的延長Jurkat細胞凋亡率升高，呈現(xiàn)劑量-效應、時間-效應關(guān)系；正常骨髓基質(zhì)細胞、白血病骨髓基質(zhì)細胞均可抑制DNR誘導的Jurkat細胞凋亡，白血病骨髓基質(zhì)細胞的抑制效應強于正常骨髓基質(zhì)細胞組，這種抑制效應可能與其阻滯Jurkat細胞于G0/G1期有關(guān)；白血病骨髓基質(zhì)細胞能誘導Jurkat細胞基因發(fā)生差異表達；本研究

12、有效地克隆了骨髓基質(zhì)細胞抑制DNR誘導Jurkat細胞凋亡過程中Jurkat細胞相關(guān)差異表達基因，這些結(jié)果為進一步在基因水平探討白血病骨髓基質(zhì)細胞保護白血病細胞逃避化療藥物殺傷的分子機理奠定了基礎(chǔ)；研究進一步在基因水平證實了Jurkat細胞CRIF1基因及其級聯(lián)基因Gadd45的表達上調(diào)，提示白血病骨髓基質(zhì)細胞抑制DNR誘導的Jurkat細胞凋亡可能與CRIF1、Gadd45高表達有關(guān)。本研究表明，G0/G1期阻滯可能是白血病骨髓基質(zhì)細