Cx43基因修飾的白血病骨髓基質(zhì)細胞對Jurkat細胞體外調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、本課題直接分離培養(yǎng)白血病BMSCs，檢測其Cx43表達水平及GJIC功能，構(gòu)建綠色熒光蛋白標記且攜帶Cx413基因的重組腺病毒載體并感染白血病。BMSCs，將Cx413基因修飾后BMSCs與白血病細胞株(Jurkat細胞)共培養(yǎng)，觀察其對Jurkat細胞增殖、分化、凋亡及藥物敏感性的影響。從改造造血微環(huán)境角度為白血病治療提供理論和實驗依據(jù)。 1．研究內(nèi)容及方法： 1．1體外分離培養(yǎng)正常人及白血病BMSCs，采用RT-PC

2、R法、免疫細胞化學法、激光共聚焦掃描(LCSM)技術(shù)檢測二者Cx43mRNA及蛋白的表達，用劃痕標記染料示蹤技術(shù)(SLDTM)檢測二者GJIC功能。 1．2采用DNA重組技術(shù)，將目的基因Cx43克隆至含有報告基因GFP的穿梭質(zhì)粒；在BJ5183細胞中與腺病毒基因組進行同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒；在脂質(zhì)體介導下，將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞進行包裝復制，分別獲得重組腺病毒Ad-Cx43-GFP、Ad-GFP；熒光倒置顯微鏡下

3、觀察轉(zhuǎn)染后293細胞GFP表達，Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后293細胞中Cx43蛋白表達。 1.3用重組腺病毒Ad-Cx43-GFP、Ad-GFP感染白血病BMSCs，采用免疫細胞化學法、RT-PCR法、LCSM技術(shù)對比感染前后Cx43蛋白表達的變化，用SLDTM對比感染前后GJIC功能的變化。 1．4建立Cx43基因修飾前后白血病BMSCs與Jurkat細胞共培養(yǎng)模型，觀察Jurkat細胞與基質(zhì)細胞間的位相關(guān)

4、系；利用MTT法檢測與Cx43基因修飾前后白血病BMSCs共培養(yǎng)的Jurkat細胞生長曲線及DT，流式細胞術(shù)檢測共培養(yǎng)后Jurkat細胞周期，凋亡率和死亡率，透射電鏡下觀察Jurkat細胞凋亡情況，免疫細胞化學法檢測共培養(yǎng)后Jurkat細胞bcl-2、p53、bax的表達；通過MTT法和流式細胞術(shù)檢測經(jīng)5-FU、HHT、As<,2>O<,3>化療藥物作用后各組Jurkat細胞存活率及凋亡率。 2．實驗結(jié)果： 2．1正常及

5、白血病BMSCs Cx43表達及GJIC功能的比較：通過半定量RT-PCR法擴增出大小約為400bp的產(chǎn)物，與預計相符，白血病BMSCs Cx43mRNA表達相對量低于正常BMSCs(P<0.05)；通過免疫細胞化學法和LCSM技術(shù)檢測，白血病BMSCsCx43蛋白表達量低于正常BMSCs組(P<0.01)；LCSM技術(shù)定位結(jié)果顯示Cx43在胞核內(nèi)均無表達表達，正常BMSCs Cx43表達主要位于胞膜，而白血病BMSCsCx43表達主要

6、在胞質(zhì)。對GJIC功能比較結(jié)果顯示：染料通過正常BMSCs需通1～2mins，通過白血病BMSCs需8mins以上；白血病BMSCs熒光傳遞強度低于正常BMSCs(P<0.01)。 2．2構(gòu)建重組腺病毒Ad-Cx43-GFP、Ad-GFP：通過PCR法從質(zhì)粒pcDNA3.0-Cx43擴增出1kb大小左右特異性Cx43基因片斷，將Cx43基因克隆至含有報告基因GFP的穿梭質(zhì)粒，線性化重組及未重組的穿梭質(zhì)粒與pAdEasy-1同源重

7、組后，經(jīng)Pac Ⅰ單酶切鑒定重組產(chǎn)物證明pAd-GFP、pAd-Cx43-GFP構(gòu)建成功；經(jīng)脂質(zhì)體介導，重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293細胞進行包裝和復制，轉(zhuǎn)染后的293細胞內(nèi)均出現(xiàn)綠色熒光，Westernblot法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pAd-Cx43-GFP的293細胞在43KDa處有明顯表達的條帶，而pAd-GFP轉(zhuǎn)染的293細胞和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的293細胞在該處呈現(xiàn)弱表達，重組腺病毒Ad-Cx43-GFP及Ad-GFP構(gòu)建成功。 2．3重組

8、腺病毒Ad-Cx43-GFP及Ad-GFP感染白血病BMSCs：感染后24h可以觀察到細胞有綠色熒光表達，感染效率分別為(82.43±3.00)％和(82.29±3.27)％；半定量RT-PCR法、免疫細胞化學法和LCSM技術(shù)檢測結(jié)果顯示：Ad-Cx43-GFP感染后白血病BMSCs Cx43mRNA表達相對量、Cx43蛋白表達量均高于Ad-GFP感染后白血病BMSCs，差異顯著；LCSM技術(shù)定位結(jié)果顯示Ad-Cx43-GFP感染后BM

9、SCs胞膜和胞質(zhì)上Cx43表達明顯增加。對GJIC功能比較結(jié)果顯示：Ad-Cx43-GFP組BMSCs熒光傳遞強度明顯高于Ad-GFP組(P<0.01)，染料通過時間少于Ad-GFP組。 2．4 Cx43基因修飾的白血病BMSCs對Jurkat細胞調(diào)節(jié)作用： 分組：Jurkat組為Jurkat細胞單獨培養(yǎng)組，BMSCs/Jurkat組為白血病BMSCs與Jurkat細胞共培養(yǎng)組，Ad-BMSCs/Jurkat組為Ad-G

10、FP感染的白血病BMSCs與Jurkat細胞共培養(yǎng)組，Ad-Cx43-BMSCs/Jurkat組Ad-Cx43-GFP感染的白血病BMSCs與Jurkat細胞共培養(yǎng)組。 3．結(jié)論： 3．1白血病BMSCs中Cx43表達水平低于正常BMSCs并出現(xiàn)表達定位異常；白血病BMSCs間GJIC功能較正常BMSCs降低； 3．2 Cx43基因高表達重組腺病毒載體Ad-Cx43-GFP構(gòu)建成功；Cx43基因修飾后白血病BMS

11、Cs間GJIC功能增強； 3．3成功建立白血病BMSCs與Jurkat細胞共培養(yǎng)模型；與Cx43基因修飾的白血病BMSCs共培養(yǎng)后，處于增殖期及自發(fā)凋亡的Jurkat細胞增加，Jurkat細胞凋亡抑制基因bcl-2及p53表達降低，凋亡活化基因bax表達增加； 3．4重建白血病BMSCs間隙連接功能使與其共培養(yǎng)的Jurkat細胞對5-Fu、HHT及As<,2>O<,3>化療藥物敏感性增強，藥物所致凋亡率增加，但是HHT對