Cx43修飾的人臍血源基質(zhì)細(xì)胞對人外周血淋巴細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的體外研究.pdf

1、目的:
　　我們關(guān)于人臍血源基質(zhì)細(xì)胞( human umbilical cord blood-derived cells, hUCBDSCs)的前期研究表明,hUCBDSC具有免疫調(diào)控作用,不僅在抑制異基因造血干細(xì)胞移植后移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)上發(fā)揮重要作用,亦能參與誘導(dǎo)免疫耐受[1][2][3]。但其具體機(jī)制及其在免疫系統(tǒng)中如何發(fā)揮調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究。連接蛋白(conn

2、exin,Cx)及其介導(dǎo)的縫隙連接細(xì)胞間通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)亦在骨髓基質(zhì)調(diào)控淋巴細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用,如影響淋巴細(xì)胞的抗體分泌,細(xì)胞因子產(chǎn)生,白細(xì)胞的遷移等。Cx43廣泛表達(dá)于骨髓、胸腺、脾臟以及其他淋巴組織,是參與造血調(diào)控的必要條件[4][5][6][7][8][9][10]。本室前期研究亦表明,骨髓基質(zhì)細(xì)胞(human bone marrow strom

3、al cells, BMSCs)主要表達(dá)Cx43,通過增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞 Cx43的表達(dá)能夠?qū)Π籽〖?xì)胞產(chǎn)生阻抑作用[11]。因此,我們在前期課題研究的基礎(chǔ)上提出設(shè)想,增強(qiáng)hUCBDSCs的Cx43表達(dá)是否可以通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能而增強(qiáng)免疫調(diào)控功能呢?本實(shí)驗(yàn)通過觀察轉(zhuǎn)染 Ad-GFP或轉(zhuǎn)染Ad-Cx43-GFP的 hUCBDSCs與外周血淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),觀察其對人外周血淋巴細(xì)胞(lymphocyte)增殖、周期、凋亡,及其細(xì)胞因子分泌、C

4、D4+CD25+T細(xì)胞比例的影響,從改善造血微環(huán)境GJIC功能角度這一新的角度探討其對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　1.采集健康產(chǎn)婦足月妊娠順產(chǎn)的臍帶血,使用本室前期構(gòu)建的穩(wěn)定擴(kuò)增體系培養(yǎng)hUCBDSCs。(6％明膠沉淀臍血紅細(xì)胞,Percoll密度梯度離心分離,改良Dexter基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系)。采用 ficoll密度梯度離心法從粒細(xì)胞集落刺激因子( granulocyte colony-stimulat

5、ing factor,G-CSF)動員后的外周血單個核細(xì)胞中分離出淋巴細(xì)胞,用倒置顯微鏡觀察hUCBDSCs、淋巴細(xì)胞生長狀況。
　　2. Ad-Cx43-GFP轉(zhuǎn)染hUCBDSCs48小時后,免疫熒光、RT-PCR及Western Blot檢測轉(zhuǎn)染前后hUCBDSCs細(xì)胞Cx43蛋白及mRNA的表達(dá)情況,熒光淬滅法觀察轉(zhuǎn)染后GJIC功能改變。
　　3.體外將轉(zhuǎn)染Ad-Cx43-GFP或未轉(zhuǎn)染的hUCBDSCs與血細(xì)胞分離機(jī)

6、采集的外周血單個核細(xì)胞并用 Ficoll密度梯度離心法分離出的淋巴細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng),共培養(yǎng)48h后,采用CCK-8檢測Cx43修飾的hUCBDSCs對淋巴細(xì)胞增殖作用的影響;采用流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞周期、凋亡。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)分選CD4+T、CD8+T細(xì)胞,將轉(zhuǎn)染Ad-Cx4-GFP的hUCBDSCs分別與淋巴細(xì)胞及分選后的CD4+T、CD+8細(xì)胞共培養(yǎng)72小時后,收集共培養(yǎng)中上清液, ELISA法檢測IL-4和IFN-γ分泌

7、水平。
　　5.共培養(yǎng)72小時后,收集懸浮淋巴細(xì)胞,加入熒光抗體CD4-PE,CD25-Alex Flour647染色,流式檢測CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例。
　　研究結(jié)果:
　　1.體外成功培養(yǎng) hUCBDSCs。普通倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)的 hUCBDSCs呈多形性,有圓形,紡錘形甚至成不規(guī)則形。培養(yǎng)24天左右傳代。傳代后細(xì)胞形態(tài)較均一,多為紡錘形。
　　2.重組腺病毒載體 Ad-Cx43-GFP能夠

8、成功轉(zhuǎn)染 hUCBDSCs,用滴度為100MOI的腺病毒載體轉(zhuǎn)染 hUCBDSCs后24h即可見到免疫熒光,轉(zhuǎn)染48h后的轉(zhuǎn)染效率為85±3.2%(1ul/孔)。轉(zhuǎn)染Ad-Cx43-GFP的Cx43mRNA及蛋白的表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染Ad-GFP組明顯增強(qiáng);轉(zhuǎn)染后的GJIC功能亦較未轉(zhuǎn)染組或轉(zhuǎn)染Ad-GFP組增強(qiáng)。
　　3.轉(zhuǎn)染 CX43后的 hUCBDSCs呈現(xiàn)雙向調(diào)控外周血淋巴細(xì)胞的增殖作用,其促進(jìn)或抑制增殖作用與hUCBDS

9、Cs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)比例有關(guān)。
　　4.當(dāng)hUCBDSCs與淋巴細(xì)胞以1:8共培養(yǎng)時,在PHA刺激下能夠促進(jìn)S+G2/M期細(xì)胞比例,而當(dāng)hUCBDSCs與淋巴細(xì)胞以1:4共培養(yǎng)時,能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的凋亡。
　　5.共培養(yǎng)后,Cx43修飾的hUCBDSCs能增加淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+T細(xì)胞比例。轉(zhuǎn)染Cx43組HUCBDSCs分泌IL-4較轉(zhuǎn)染Ad-GFP組增加,而IFN-γ分泌受到抑制。
　　結(jié)論:
　　1.