VCAM-1基因修飾人臍血源基質細胞移植重建造血微環(huán)境功能.pdf

1、骨髓造血微環(huán)境(hematopoieticinductivemicroenvironment，HIM)是造血干/祖細胞生長發(fā)育的“土壤”，基質細胞作為造血微環(huán)境中的重要成分，不僅與造血干/祖細胞的歸巢定位、增殖分化和自我更新密切相關，而且在某些血液系統疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉歸過程中具有非常重要的作用，探討基質細胞在造血調控中的作用需繼續(xù)深入。人臍血中的細胞成分豐富且較骨髓和外周血更原始；臍血細胞具有來源廣泛、采集方便、GVHD輕和高增殖的

2、特點，臨床應用前景廣闊。目前對造血基質細胞的研究主要側重于骨髓基質細胞，而對于臍血中是否存在基質細胞，臍血源基質細胞的生物學特點如何，能否作為一種新型的造血基質細胞來源等問題尚缺乏系統深入的研究；血管細胞粘附分子(vascularcelladhsionmolecule-1，VCAM-1)是骨髓基質細胞參與造血調控不可缺少的粘附分子，它與受體整聯蛋白(Integrin)家族中的α4β1特異性結合能起到固定造血干細胞于骨髓基質的作用，對造血

3、干/祖細胞的增殖、分化、遷移中發(fā)揮重要調控作用。 鑒于此，本課題將人臍血CD34+細胞，采用Dexter貼壁細胞培養(yǎng)體系行臍血源基質細胞培養(yǎng)，探討人臍血細胞體外擴增基質細胞的可行性和有效性；研究人臍血源基質細胞微環(huán)境的造血支持作用；構建熒光蛋白標記的VCAM-1腺病毒載體并轉染人臍血源基質細胞，移植給造血微環(huán)境輻射損傷裸鼠，探討其對重建造血微環(huán)境功能及促進造血損傷修復的作用，為平戰(zhàn)條件下造血功能損傷的救治提供新的輔助治療措施。

4、 1.研究內容及方法： 1.1分離人臍血CD34+細胞，采用Dexter貼壁細胞培養(yǎng)體系行臍血源基質細胞培養(yǎng)、傳代擴增，采用光鏡，電鏡、組織細胞化學、免疫細胞化學和流式細胞儀等技術對臍血源基質細胞進行鑒定； 1.2采用DNA重組技術，將目的基因VCAM-1克隆至含有報告基因EGFP的穿梭質粒；在BJ5183細胞中與腺病毒基因組進行同源重組，產生重組腺病毒；在脂質體介導下，將重組的腺病毒表達質粒轉染293細胞，使腺病

5、毒在293細胞中包裝復制，并對轉染后的293細胞進行熒光觀測，檢測培養(yǎng)上清目的蛋白的表達；用高效轉染載體將VCAM-1基因修飾人臍血源基質細胞并檢測其表達； 13ELISA檢測臍血源基質細胞造血生長因子GM-CSF、SCF、TPO的表達水平，RT-PCR方法檢測GM-CSF、SCF、TPO等指標mRNA表達水平；對比觀察有、無VCAM-1基因修飾的人臍血源基質細胞對臍血干\祖細胞體外擴增能力的異同； 1.4對裸鼠分別實施

6、Co60γ3.5Gy、5Gy、6.5Gy、8Gy輻射劑量損傷，觀察裸鼠輻經射損傷后不同時相點的血象、骨髓像、骨髓病理切片、CFU-F、VCAM-1等指標變化，探索適合本研究有關的造血微環(huán)境損傷的動物模型的適宜輻射劑量； 1.5本研究分為經裸鼠尾靜脈輸注生理鹽水對照組、無VCAM-1修飾的人臍血源基質細胞和VCAM-1修飾的人臍血源基質細胞等實驗組，探討造血微環(huán)境輻射損傷裸鼠的造血功能損傷的恢復及其機制。 2.實驗結果：

7、 2.1人臍血源基質細胞的培養(yǎng)和鑒定：人臍血源基質細胞在形態(tài)學上具有“成纖維樣”、“巨噬樣”、“小圓樣”細胞等三種主要形態(tài)。細胞化學染色提示：①非特異性酯酶染色法(NSE)：陽性，陽性率100％；②過氧化物酶染色法(POX)：陰性；③糖原染色(PAS)：陽性，陽性率100％；④堿性磷酸酶(ALP)染色：部分陽性，陽性率28％。免疫細胞化學染色提示：①CD106(VCAM-1)：陽性率16％；②CD29(整合素-β1)：陽性率93％

8、；③CD44：陽性率98％；④CD45：陰性；⑤CD50：陽性率62％；⑥纖維粘連蛋白(Fn)：陽性率92％；⑦層粘連蛋白(Lm)：陽性率74％；⑧膠原Ⅳ：陽性率83％。經對臍血源基質細胞的細胞培養(yǎng)貼壁率、CFU-F計數、透射電鏡、細胞周期、生長曲線等檢測的結果提示，人臍血源基質細胞具備造血基質細胞的生物學特點； 2.2將VCAM-1克隆至含有報告基因EGFP的穿梭質粒；在BJ5183細胞中與腺病毒基因組進行同源重組，產生Ad-

9、VCAM-1-EGFP重組腺病毒質粒；經脂質體介導，重組腺病毒質粒轉染293細胞進行復制，轉染后的293細胞內可見熒光顯示，WestemBlot檢測培養(yǎng)上清有目的蛋白表達；將VCAM-1基因導入人臍血源基質細胞，熒光顯微鏡可觀察到轉染后的臍血源基質細胞的胞質內顯示綠色熒光，并半定量RT-PCR和免疫細胞化學方法證實目的基因的轉錄和表達； 2.3RT-PCR和ELISA法檢測：體外原代培養(yǎng)的人臍血源基質細胞能表達和分泌GM-CSF

10、、SCF和TPO。與骨髓基質細胞比較：GM-CSF和SCF的表達較骨髓基質細胞低(P＜0.01)，而TPO的表達水平較骨髓基質細胞高(P＜0.05)；HUCBSC為滋養(yǎng)層的擴增體系能夠對臍血CD34+細胞進行有效擴增，擴增后的臍血CD34+細胞形成的CFU-GM、CFU-E和CFU-MEG顯著高于對照組(P＜0.01)，其中以VCAM-1-HUCBSC組對CD34+細胞的擴增作用最佳(P＜0.01)； 2.48.0Gy輻射劑量裸

11、鼠死亡率100％；3.5Gy、5Gy、6.5Gy輻射劑量組裸鼠的造血損傷均能在輻射后21之內自我恢復，絕大部分裸鼠能存活；6.5Gy組骨髓CFU-F于移植后+7(22±6)、+14天(33±6)較3.5Gy、5Gy組均具有顯著性差異(P＜0.01)，VCAM-1表達于+7(21.67±7.45)、+14天(22.33±9.07)、+21天(23.33±4.51)較對照組具有顯著性差異(P＜0.01)、較3.5Gy組有顯著性差異(P＜0.

12、05)，+21天(23.33±4.51)較5Gy組(34.00±4.36)顯著性差異(P＜0.05)； 2.5HUCBSC輸注具有修復輻射損傷造血微環(huán)境的作用并具有促進輻射造血功能損傷恢復的作用(P＜0.05)，在血象、骨髓像恢復時間、骨髓病理切片、CFU-F、CFU-GM、BFU-E、CFU-Meg、VCAM-1等檢測結果與生理鹽水對照組具有顯著性差異(P＜0.05)；VCAM-1修飾的人臍血源基質細胞移植組的療效顯著(P＜0

13、.01)。 3.結論： 3.1人臍血中存在造血微環(huán)境基質細胞的前體細胞，體外培養(yǎng)的人臍血源基質細胞具有造血基質細胞的基本特點； 3.2成功構建VCAM-1基因高表達體系，Ad-VCAM-1-EGFP重組腺病毒載體可成功轉染人臍血源基質細胞，并使其VCAM-1表達增高； 3.3人臍血源基質細胞具有自分泌GM-CSF,SCF,TPO等造血生長因子能力，體外實驗證實人臍血源基質細胞具有促進造血干/祖細胞擴增的能