TPO基因轉(zhuǎn)染小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)造血功能重建的研究.pdf

1、目的：造血干細(xì)胞移植(hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT)是治療惡性血液病、放化療敏感的實(shí)體腫瘤以及急性放射病的重要手段。HSCT后造血重建緩慢，出現(xiàn)骨髓造血抑制期，白細(xì)胞、血小板少，感染和出血成為移植后的主要并發(fā)癥之一，也是移植相關(guān)死亡的主要原因。目前認(rèn)為HSCT后造血重建緩慢與基質(zhì)損傷、缺乏合適的促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞增殖、分化的微環(huán)境有關(guān)。自G-CSF、GM-CSF應(yīng)用于臨床以來(lái)，明顯地

2、縮短了中性粒細(xì)胞缺乏時(shí)間，降低了感染的發(fā)生率。然而目前針對(duì)因血小板減少引起的急性出血，臨床上主要依賴輸注血小板懸液，但長(zhǎng)期輸注血小板有可能帶來(lái)許多嚴(yán)重副作用，存在價(jià)格昂貴、反復(fù)輸注產(chǎn)生血小板抗體導(dǎo)致無(wú)效性血小板輸注等諸多問(wèn)題。已證實(shí)，TPO是調(diào)控血小板生成的首要、特異性因子。因此，本課題以微環(huán)境的主要成分——骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)為靶細(xì)胞，用脂質(zhì)體將含小鼠TPOcDNA編碼區(qū)的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，通過(guò)觀察轉(zhuǎn)染TPO基因的BM

3、SCs移植對(duì)放射損傷后小鼠在血小板恢復(fù)及造血重建方面的作用，探索基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的造血生長(zhǎng)因子基因治療促進(jìn)造血功能重建的可行性。 方法：體外部分：參照Dexter法分離培養(yǎng)小鼠BMSCs，免疫細(xì)胞化學(xué)法及細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定小鼠BMSCs，脂質(zhì)體介導(dǎo)含小鼠TPOcDNA編碼區(qū)的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs，RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)法及Westernblot法檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)染BMSCs后TPO在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，以轉(zhuǎn)染空載體(p

4、cDNA3.1)質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的BMSCs作為對(duì)照。體內(nèi)部分：采用單次劑量6.5Gy的60Co-γ射線照射受體鼠，照射后動(dòng)物隨機(jī)分四組，單純骨髓細(xì)胞移植組(A組)、未轉(zhuǎn)染BMSCs+骨髓細(xì)胞移植組(B組)、轉(zhuǎn)染TPO基因的BMSCs+骨髓細(xì)胞移植組(C組)、轉(zhuǎn)染空載體的BMSCs+骨髓細(xì)胞移植組(D組)，分別于照射后24小時(shí)內(nèi)給予骨髓細(xì)胞、BMSCs移植，在不同時(shí)相點(diǎn)進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)，取股骨骨髓細(xì)胞行瑞氏染色，肝、脾組織行HE染色，進(jìn)行組織

5、病理學(xué)檢測(cè)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下： 1.小鼠BMSCs的培養(yǎng)及鑒定BMSCs形態(tài)呈異質(zhì)性，原代細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，傳代后則均勻生長(zhǎng)，免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示小鼠抗小鼠波形蛋白陽(yáng)性，大鼠抗小鼠DC單抗陰性，證實(shí)為小鼠BMSCs。 2.轉(zhuǎn)染后BMSCs其TPO在mRNA和蛋白水平的表達(dá)RT-PCR結(jié)果：TPO基因轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞TPO與GAPDH光密度比值分別為0.622±0.011、0.182±0.01

6、4和0.172±0.007，免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示：TPO基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞胞漿呈陽(yáng)性表達(dá)，余2組陰性，Westernblot結(jié)果：TPO基因轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞TPO與GAPDH光密度比值分別為0.74±0.06、0.28±0.04和0.30±0.04，TPO基因轉(zhuǎn)染組細(xì)胞mRNA和蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P均＜0.01)，表明轉(zhuǎn)染成功。 3.TPO基因轉(zhuǎn)染小鼠BMSCs對(duì)放射損傷小鼠造血功能重建的影響 3.1血

7、細(xì)胞計(jì)數(shù)：B組、C組、D組WBC最低值較A組高(P均＜0.05)，且WBC的恢復(fù)時(shí)間提前約7天，同時(shí)有一定程度加速Plt的恢復(fù)(P均＞0.05)。A組、B組、D組Hb持續(xù)緩慢下降，至第28天達(dá)最低值，而C組于照射后14天降至最低點(diǎn)，然后逐漸回升，第28d時(shí)Hb水平較A組、B組、D組高(P均＜0.05)。C組Plt下降程度輕，最低值較A組、B組、D組高(P均＜0.05)，且維持在較高水平，同時(shí)有顯著促進(jìn)Hb恢復(fù)的作用(P均＜0.05)。

8、 3.2細(xì)胞組織學(xué)檢測(cè)：C組較A組、B組、D組骨髓和脾臟均可見明顯的巨核細(xì)胞數(shù)量增多，各組骨髓組織內(nèi)均未見纖維化，肝臟內(nèi)未見任何造血組織(包括巨核細(xì)胞)分布。 結(jié)論：脂質(zhì)體介導(dǎo)真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs方法可行，通過(guò)體外檢測(cè)TPO在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)TPO基因轉(zhuǎn)染組TPO的表達(dá)明顯增多，體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示，骨髓細(xì)胞聯(lián)合BMSCs移植有利于造血快速重建，主要是加速WBC的恢復(fù)，而TPO基因療法主要促進(jìn)Plt的