pdsred1—n1基因核轉(zhuǎn)染兔原代骨髓基質(zhì)細胞的實驗研究

1、解 放軍 醫(yī)學(xué) 雜志 2 0 0 5年 l O月 第 3 O卷 第 l O 期 Me dJC h i nP lAVo l3 0N o1 0O c t o b e r2 0 0 5T r a n s f e rp Ds Re d l — N1i n t op r i ma r yr a b b i tb o n ema r r o w s t r o ma lc e l l sb yn u c l e o f e c t i o nCh

2、 e nZ h e n z h o uXuRu x i a n gJ i a n gX i a o d a nT e n gX i a o h u aZ h o uHu t i a n·88 1·A b s t r a c tO b j e c t i v eT oa p p r o a c ht h ef e a s i b i l i t yo ft r a n s f e c t i n gt h eD NAp

3、 l a s m i do fe n c o d i n gr e df l u o r e s c e n tp r o t e i nd i r e c t l yi n t ot h en u c l e u so fr a b b i tp r i ma r yb o n ema r r o w s t r o ma lc e l lwi t hr e ce n t l yd e v e l o p e dn u c l e

4、o f e c t i o nt e c h n i q u e ． Me t h o d sRa b b i tp r i m a r yb o n eH l a r r o w s t r o ma l c e l l s( BMS C s ) we r eh a r v e s t e d b yme a n so fd e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o

5、nf o l l o w in g at h i g h b o n ep u n c t u r e ．Th ep r i ma r yBMS Cswe r ec u l t u r e d a n de i t h e rt r a n s f e ct e d t op Ds Re d lN1b yn u c l e o f e c t o r Tt e c h n i q u e( a sDs Re d g r o

6、u p )o rl e f tu n in f e ct e d ( a sc o n t r o lg r o u p )i nv i t r o ．Th ec e l l u l a rv ia b i l i t y， a d h e s i v er a t e ， t h eg r o wt hc u r v e sa n dt h ee f f i c i e n c yo ft r a n s f e c t i o no

7、 fb o t hI NRe d a n dc o n t r o lg r o u p swe r ea n a l y z e d ． Re s u l tDs Re d we r es u c c e s s f u l l ye x p r e s s e d a t4 8 ha f t e rn u c l e o f e ct i o n ． S i mi l a rmo r p h o l o g ye v o l

8、v e me n t ，a d h e s i v er a t e sa n dg r o w t hc u r ve swe r eo b t a i n e df r o m t h et wog r o u p s ．Th ep o s i t i v eDs Re d e x p r e s s i o ne n h a n c e d g r a d u a l l ya l o n ew i t hap r o

9、l o n g e d c u l t u r in gt i me ．a(chǎn) n dr e a c h e di t sp e a kv a l u ea tt h e1 0 md a ya f t e rm a r k e d ， w i t ha b o u t5 4 ． 2o fD s Re dp o s i t i v ec e l l si nt h et o t a lBM固 ．Th eDs Re dd i dn o ta

10、t t e n u a t ee v e nu n t i l1mo n t hf o l l o w i n gt h em a r k ．~ u s i o nNe u c l o f e ct i o no fp D s Re d lN1s h o we d n os i g n i f i c a n te f f e c to nt h ep r o l i f e r a t i o no fr a b b i tBMS

11、~ Cs ．Ds Re dwo r k e d e f f i c i e n t l yf o rt h ep u r p o s eo fs t a b l eg e n em a r k i n go fr a b b i tBM t S C ． s ， a n dn u c l e o f e ct i o ni sa ne f f i d e n tme t h o df o rt r a n s f e r r in g

12、 g e n e si n t op r i n mr yr a b b i tB M S Cs ．Ke ywo r d sr e d f l u o r e s c e n tp r o t e i n；b o n em a r r o w s t r o m a lc e l l s ；n u c l e o f e ct i o n ；r a b b i tcL c Nu mb e rR3 2 9 ． 2 8p D s

13、R e d l — N 1 基因核轉(zhuǎn)染兔原代骨髓基質(zhì)細胞的實驗研究 陳鎮(zhèn) 洲徐 如祥 姜 曉 丹 滕 曉 華 周 虎 田摘 要 目的 探討 以最 近發(fā) 展起米 的核 轉(zhuǎn) 染技 術(shù)直接 將 編碼 紅 色熒 光 蛋 白 D N A 質(zhì)粒 轉(zhuǎn) 染 到兔 原 代 骨髓 基 質(zhì) 細 胞 細胞 核 內(nèi) 進 行基 因修 飾 的可行 性 。方法 從兔 股骨 抽取 骨髓 ， 密度 梯度 離 心法 獲 取原 代 骨髓 基 質(zhì) 細胞 。 以 Nu c l e

14、 o f e c t o r T技 術(shù)轉(zhuǎn) 染 p D s R e d l —N1 ( I Y s R e d組 ) ， 以同期 培養(yǎng) 未轉(zhuǎn)染 的 細胞作 為對 照組 。測 定細 胞 的活力 、 貼壁 率 、 生 長 曲線 以及 轉(zhuǎn) 染的效 率 。結(jié)果 在 轉(zhuǎn)染 后 4 8 h成 功 發(fā)現(xiàn) D s R e d的表達 。兩 組細 胞 具 有 相 似 的 形態(tài) 學(xué) 變 化 、 貼 壁 率 以及 生 長 曲線 。D s R e d的表 達 逐

15、漸 增 強 ， 至 第 1 O天 達 到 最 高 峰 ( 5 4 ． 2) ， 觀 察 1 個月 未發(fā) 現(xiàn)表 達減 弱 。結(jié)論 p D s R e d lN1 基 因核轉(zhuǎn)染 對 兔原 代骨髓 基 質(zhì)細胞 的體 外 增殖無 明顯 影 響 ； D s R e d可 以 作 為兔 骨髓 基質(zhì) 細胞 有效 的基 因表達 標(biāo)記 ； N u c l e o f e c t o r T技 術(shù)是 一種 簡易 而高 效 的轉(zhuǎn)染 兔原 代骨髓 基 質(zhì)細胞

16、的方法 。關(guān)鍵 詞 紅 色熒 光蛋 白 ； 骨髓 基質(zhì) 細胞 ； 核轉(zhuǎn) 染 ； 兔 中國 圖書資料 分 類號 R 3 2 9 ． 2 8D o n em a r r o w s t r o ma lc e l l s ( B M S , K； s ) c a nd i f f e r e n t i a t ei n t oma n yt y p e so fm e s e n c h y ma lc e l l s ， Bg ． o

17、 s t e o b l a s t ， c h o n d r o b l a s ta n dl i p o b l a s t ． a n dc a na l s od i f f e r e n t i a t ei n t on o n - m e s e n c h y ma lc e l l s ， Bg ． n e u r a lc e l l su n d e ra p p r o p r i a t ei nv i

18、w oe x p e r i me n t a lc o n d i t i o n s EJ ． T h e yc a nt h e r e f o r eb ea ni d e a 1c e l ls o u r c ef o rt h e r a p yo fi n h e r i t e do rd e g e n e r a t i v ed i s e a s e s ． I n v e s t i g a t i o n

19、so fB M S C s ，h o we v e r ，h a v es o f a rb e e nh a m p e r e db vt h ef a c tt h a tt h e s ec e l l sc o u l do n l yb eg e n e t i c a l l ymo d i f i e du s i n gr e t r o v i r a lv e c t o rs y s t e m s ．H e

20、 r e ， wed e s c r i b et h eu s eo fr e c e n t l yd e v e l o p e d n u c l e o f e c t i o nme t h o d，i nwh i c ht h ep l a mi dDNA i sd e l i v e r e dd i r e c t l yi n t ot h en u c l e u sf o rt h ei n t r o d

21、u c t i o no fap l a s mi de n c o d i n ge n h a n c e d r e d f l u o r e s c e n tp r o t e i ni n t op r i m a r yB M S Csi nr a b b i t ．1M e t h o d s1 ． 1Pr e p a r a t i o no ft h er a b b i tB M S Cs1 ． 5 - m

22、o n t h - o l dNe w Z e a l a n dwh i t er a b b i t swe r eo b t a i n e df r o m t h eAn i m a lC e n t e ro ft h eNa n f a n gM e d i c a lU n i v e r s i t y ． Al lp r o c e d u r e si n v o l v i n gt h eu s eo fr

23、a b b i t swe r ea p p r o v e db yt h eAn i m a lRe s e a r c hC o mmi t t e eo fN a n f a n gM e d i c a lU n i v e r s i t y ． U n d e rt h es t e r i l ec o n d i t i o n ． 2 mlt o4 m lb o n em a r r o w wa sd r a w

24、 nwi t hn e e d l ea s p i r a t o rf r o m e a c ho fr a b b i tt h i g h I x ) n e ． Th eb o n em a r r o w m a t e r i a lwa sd i l u t e d1 ： 1wi t hDu l b e c c o' smi n i m a le s s e n t i a lme di a ( D MEM

25、，GI LA ' ) ／ B RL)a n dc e n t r i f u g e dt h r ou g had e n s i t yg r a d i e n t ( F i c o l lP a q u eP l u s ．1 ． 0 7 7 g ／ml ，P h a r ma c i a )f o r2 0 r ai na t2 5 0 0r ／ r r f i n ．Th ec e l l swe r ec ol

26、l e c t e df r om mo n o n u c l e a re e l I 1 a y e ra n ds u s p e n d e di nt h e“ C y t i o k i n eNS C sme d i u m ” ( p r e p a r e d b yo u rl a b ，P a t e n tNo ． Z L 0 2 1 3 4 3 1 4 ． 4 ) ． Th e nt h e ywe r

27、 ei n c u b a t e d a t3 7 ℃ i n5o i np o l y e t h y l e n ep l a s t i cp l a t e sf o r2d a y sa n dn o n a d h e r e n tc e l l swe r ed i s c a r d e d b yr e mo v i n gt h eme d i u m． Th ea d h e r e d c e l

28、 l sr e p r e s e n t e d ap o p u l a t i o no fp r i m a r yB M S C s ． T h e ywe r ed e t a c h e d 、 v i t hO ． O 5t r y p s i na n dd i v i d e di n t oc o n t r o lg r o u pa n dDs Re dg r o u p ．1 ． 2P l a s m i

29、 dn u c l e o f e ct i o nHU I T l S nMS CNu c l e o f e ct o r Tk i ta n dTh eNu c l e o f e ct o rd e v i c ewe r ep u r c h a s e df r om l a x aI n c ． US 八 C e n t r i f u g et h er e q u i r e d n u mb e ro fp r

30、 i m a r yB M S C s ( 5× 1 0c e l l sp e rn u c l e o f e ct i o ns a mp l e )a t2 0 0 gf o r1 0m i n ． D i s c a r ds u p e r n a t a n tc o m p l e t e l ya n dr e - s u s p e n dt h ec e l li nHu m a nM S CNu c l

31、 e o f e c t o r ?s ol u t i o nt oaf i n a lc on c e n t r a t i o no f5 × 1 0c e l l s ／ 1 0 0 ~ 1 ．T h e nm ixt h es u s p e n s i o nw i t h2gp Ds Re d 1 一 N1 ( C l o n t e ch ， US A ) a n dt r a n s f e ri ti n

32、 t oa nAma x ac e r t i f i e dc u v e t t e ． S t a r tp r o g r a m U一 2 3 ．Th ec e l l swe r et h e nt r a n s f e r r e df r o m t h ec u v e t t ei n t o6we l lp l a t e si mme di a t e l ya f t e rt h ep r og r a

33、 m h a df i n i s h e d ，c u l t u r e d i n“ Cy t o k i n eNS Csme d i u m”s u p p l e me n t e d w i t h1 0f e t a lb o v i n es e r u m ( F B S )a n di n c u b a t e di nah u m i d i f i e d3 7Ca n d50 【 ) ，i n c u

34、 b a t o r ． Th eB i o g r a p h y ： C h e nZ h e n z h o u ， P u t i a no r i g i n ， F u j i a nP r o v ． ； c an d i d a t ef o r Ⅳ 皿 T e l ：0 2 ( >6 1 6 4 3 2 7 0；E - ma i 1 ：c z z 1 0 2 0 @ s o h u ． c o m O r g

35、a n i z a t i o n ． D e p a r t me n to fN e u r o s u r g e r y ， Z h u j i a n g Ho s p i t a lA f f i l i a t e d t oNa n f a n g Me d i c a lUn i v e r s i t y，Gu a n g z h o u，Ch in a5 1 0 2 8 0 ( Ch e nZ h e n

36、z h o u．XuRu x i a n g ， J i a n gxi a o d a n，n gXi a o h u a ，Zh o uHu t i a n )F o u n d a t i o n ：Su p p o r t e d b yNa t i o n a lNa t u r eS c i e n c eFo u n d a t i o no fCh in a( No ． 3 0 2 7 0 4 9 ) ， t h eF

37、u n d sf o rKe yS c i — t e c hR e s e a r c hP r o j e c t so fGu a n g d o n gP r o v i n c e[ Y UEK 日I B A N( 2 0 0 0 ) 2 5a ndYU EC AI QI2 0 0 1 ( 3 6 7 ) ， 2 0 0 3( 2 0 9 ) ]a ndo ft h eA r my [ [ 0 1 Z 0 5 4 3維普資訊

38、http://www.cqvip.com 解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2 0 0 5 年 1 0 月 整堂 笙 塑： 壘!!!+ q 0 00 t I JdF i g u r e5Ds Re dr a t e ()c u r v ev i r a lv e c t o r s ， n o n - v i r a lv e c t o r ss u c ha sl i p o s o mea n ds y n t h e t i cp o l

39、y m e r sh a v eb e e nd e v e l o p e d ． Ho we v e r ， t h ed r a wb a c kwi t ht h e s ea l t e r n a t i v e si st h a tt h e ys h o w l o wt r a n f e c t i o ne f f i c i e n c y ．T h eNu c l e o f e c t o rt e c

40、h n o l o g yn o w p e r mi t sf o rt h ef i r s tt i mean o n - v i r a la n de f f i c i e n tt r a n s f e c t i o no ft h e s ec e l l s [’’． I ti sb a s e do nt w oc o mp o n e n t s ：t h eNu c l c o f e c t o rDe

41、v i c et h a td e l i v e r su n i q u ee l e ct r i c a lp a r a me t e r s ，a n dNu c l e o f e ct o rKi t st h a tc o n t a i nc e l l — t y p e - s p e c i f i cNu c l e o f e ct o rS o l u t i o n s ．F l u o r e s c

42、 e n tp r o t e i n sa r eg e n e r a t i n gf r e s hi n s i g h ti n t op l a n tc e l lf u n c t i o nb yp r o v i d i n gn e wo p p o r t u n i t i e st ov i s u a l i z es t r u c t u r ea n dd y n a m i ce v e n t

43、si nl i v ec e l l s． I to f f e r ss e v e r a la d v a n t a g e so v e rc o n v e n t i o n a lg e n e - b a s e dr e p o r t e r s ， s u c ha sl a c Za n da l k a l i n ep h o s p h a t a s e ， i nt h a ti t sv i s u

44、 a l i z a t i o nd o e sn o tr e q u i r eac h r o mo g e n i cs u b s t r a t ea n dc a nb er e a l i z e di nv i v o ． Th eg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n( GF P)f r o m t h ej e l l y f i s hAe q u o r e

45、av i c t o r i ah a sb e c o m ea ni m p o r t a n tma r k e ro fg e n ee x p r e s s i o n ． GF Pm u t a n t sw it hb l u e ， c y a n，a n dy e l l o w i s hg r ene m i s s i o n sa r en o w a v a i l a b l e ，h o we v

46、e r ， n o n ew i t he m i s s i o nma x i m al o n g e rt h a n5 2 9 r n ~L． A b r e a k t h r o u g hi nt h eq u e s tf o rl o n g e rwa v e l e n g t hn a t u r a l l yf l u o r e s c e n tp r o t e i n swa st h ec l o

47、 n i n gb yM a t ze ta l． ( ) fs i xa n t h o z o a nf l u o r e s c e n tp r o t e i n s ． D s R e d ， a2 8 k D ap r o t e i na si ti sn o wk n o wnc omme r c i a l l y ，wa sf r o m ar e d p o r t i o no faDi s c o s

48、o m a s p e c i e sa n dh a de x c i t a t i o na n de m i s s i o nm a x i m a a t5 5 8a n d5 8 3 n m ，r e s p e c t i v e l y ，t h el o n g e s ty e tr e p o r t e d f o raw i l d — t y p es p o n t a n e o u s l

49、yf l u o r e s c e n tp r o t e i n ~． W en o wh a v ek n o w n t h a tI ) S Re dh a sam u c hh i g h e re x t i n c t i o nc o e f f i c i e n ta n dq u a n t u m y i e l dt h a nGF P， p l u se x c e l l e n tr e s i

50、 s t a n c et oPHe x t r e me sa n dp h o t o b l e a c h i n g ， wh i c hwe r es i g n i f i c a n t l yb e t t e rt h a nt h o s eo fGF P ． Ho we v e r ，D s R e d h a sm a j o rd r a w b a c k s ， s u c ha ss t r o n

51、 go l i g o m e r i z a t i o na n ds l o wm a t u r a t i o n， wh i c hw i l lp r e c l u d ea t t e m p t st ou s eDs Re da sar e p o r t e ro fs h o r t — t e r m g e n ee x p r e s s i o na n dm a n ya p p l i c a

52、t i o n st ot r a c kf u s i o np r o t e i n si no r g a n i s ms m ．I np r e s e n ts t u d y ， t h ea u t h o r sa n a l y z e d t h eu s eo fr e c e n t l yd e v e l o p e d n u c l e o f e ct i o nf o rt h et r

53、 a n s f e c t i o no fr a b b i tB M S Csw i t hp D s R e d l — N1 ． B e c a u s ei ti sa ne l e c t r o p e r a t i o n - b a s e d t r a n s f e ct i o nme t h o dt h a te n a b l e st h eDNA t oe n t e rd i r e c t

54、 l yt h en u c l e u s ， t h et a r g e tg e n ed o e sn o ta t t e n u a t ea l o n gw i t ht h ec e l l sg r o wt ha n ds p l i t ．W ewe r ea b l et ot r a n s f e c tp r i m a r yr a b b i tB MS Csw i t hh i g he f f

55、i c i e n c i e s ( 5 4 ． 2) ， a n dt h ep r o p o r t i o na n di n t e n s i t yo ff l u o r e s c e n c eo ft h et r a n s d u c e d c e l l ss t a b l ef o ra tl e a s t1mo n t h ．G e l lv i a b i l i t yd e c r e

56、a s e d f r o m 9 7b e f o r et o8 10 A2 4h o u r sa f t e r· 8 8 3·n u c l e o f e c t i o n ． T h eAd h e s i v er a t e sa n dt h eg r o w t hc u r v e so ft h el a b e l e d c e l l sa n dt h ec o n t r

57、 o lwe r es i m i l a r ， wh i c hs u g g e s tNe u c l o f e c t i o no fp Ds Re d lN1s h o we dn os i g n i f i c a n te f f e c to nt h ep r o l i f e r a t i o no fr a b b i tB M S C s ． Ho we v e r ， f u r t h e rs

58、t u d i e sa r en e e d e d t od e t e c ti fD s R e da f f e c tt h ed i f f e r e n t i a t i o np o t e n c yo fB MS C s ．Al t h o u g hHa d j a n t o n a k i se ta l。 。．S u g g e s t e d t h a tDs Re d s i g n a l

59、wa sn e v e rh o mo g e n e o u s ，ar e c e n tr e s e a r c hd e mo n s t r a t e d Ds Re dd i dn o tc h a n g et h ec h a r a c t e r is t i c so fh u m a nE mb r y o n i cs t e m c e l l s ， e s p e c i a l l yt h e

60、 i rc a p a c i t yt od i f f e r e n t i a t ei n t ome s o d e r m ，e n d o d e r m，a n de ct o d e r r nc e l lt y p e s ．I ns u mm a r y ，a sas p e c t r a l l yd i s t i n c tc o m p a n i o no rs u b s t i t u t ef

61、 o rt h eGF P， D s Re dw o r k se f f i c i e n t l yf o rt h ep u r p o s eo fs t a b l eg e n em a r k i n go fr a b b i tB M S C s ， a n dn u c l e o f e c t i o ni sa ne a s ya n dh i g h l ye f f e c t i v ea l t e

62、r n a t i v en o n - v i r a lm e t h o df o rt h et r a n s f e c t i o no fp r i m a r yr a b b i tB M S C s ，wh i c ho f f e r sn e wo p p o r t u n i t i e sf o rv a r i o u sr e s e a r c ha p p l i c a t i o n s ．R

63、e f e r e n c e s1J i a n gY， J a h a g i r d a rB N， R e i n h a r d tR Le ta lme s e n c h y ma ls t e m c e l l sd e r i v e df r o m a d u l tma r r o w．( 6 8 9 3 ) ：4 1 — 9P l u r i p o t e n c yo f2Al t ma nS A．

64、Ra n d e r sI． Ra oG． C o mp a r i s o no ft r y p a nb l u ed y ee x c l u s i o na n df l u o r o me t r i ca s s a y sf o rma mma l i a nc e l lv i a b i l i t yd e t e r mi n a t i o n s ．B i o t e c h n o lP r o g，1

65、 9 9 3 ，9( 6 )：6 7 1 — 43De n i z o tF． L a n gR Ra p i dc o l o r i me t r i ca s s a yf o rc e l lg r o wt ha n ds u r v iv a lMo d i f i c a t i o nt ot h et e t r a z o l i u m d y ep r o c e d u r eg i v in gi mp r

66、 o v e ds e n s i t i v i t ya n dr e l i a b i l i t y ．JI mmu n o lM e t h ， 1 9 8 6 ，8 9( 2 ) ： 2 7 1 —74Ha n l n lA，k r o t tN，B r e i b a c hIe ta 1 ．Ef f ic i e n tt r a n s f e c t i o nme t h o d f o rp r i ma

67、r yc e l l s ．Ti s s u eEn g ，2 0 0 2，8 ( 2 ) ：2 3 5 — 4 55L o r e n zP． Ha r n a c kU ．M o r g e n s t e m R E f f i c i e n tg e n et r a n s f e ri n t om u r in ee mb r y o n i cs t e m c e l l sb yn u c l e o f e

68、c t i o n ． B i o t e c h n o lL e t t ，2 0 0 4 ，2 6( 2 0) ：1 5 8 9 — 9 26D i s t l e rJ H， J u n g e lA，K u r o ws k ~S t o l a r s k aM e ta 1 ． N u c l e o f e c t i o n ：an e w， h i g h l ye f f i c i e n tt r a n s