腺病毒介導促軟骨生長因子基因轉染兔自體骨髓基質干細胞修復關節(jié)軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的 以復制缺陷的腺病毒Adeno-X<'TM>為基因轉移載體,制備攜帶TGF-β1和BMP-7等促軟骨生長細胞因子基因的高滴度腺病毒液,感染兔骨髓基質干細胞,利用外源性基因編碼的生長因子誘導其表達軟骨細胞表型.再將軟骨前體細胞與同種異體骨基質明膠支架相復合,在體外構建組織工程化軟骨,移植修復兔自體膝關節(jié)軟骨缺損,觀察該方法的可行性和有效性,以期找到一種較好的修復關節(jié)軟骨缺損的方法.方法 (1)采用逆轉錄PCR方法自多種組織和細胞總RN

2、A中擴增獲得轉化生長因子β1基因,經測序后與Genebank中序列進行比較分析.(2)將hTGF-β1和hBMP-7基因分別亞克隆至穿梭質粒p-Shuttle上,經PI-SceⅠ和I-CeuⅠ雙酶切后與線性化腺病毒骨架質粒Adeno-X連接,構建重組腺病毒質粒.鑒定后再經Lipofectamine 2000轉染HEK 293細胞,包裝出高滴度的重組腺病毒液.(3)采用密度梯度離心法自骨髓中分離培養(yǎng)人骨髓基質干細胞,觀察原代及傳代MSCs

3、形態(tài)特點、生長特性和特殊染色,探討其作為軟骨組織工程種子細胞的可行性.(4)用攜帶外源性目的基因的腺病毒感染人MSCs,觀察感染前后MSCs形態(tài)及生長周期的變化,利用PCR、免疫組織化學染色及Western blot鑒定重組腺病毒目的基因表達情況.(5)取兔髂骨和四肢骨,經脫脂、脫鈣、去蛋白處理獲得骨基質明膠,與腺病毒感染后的兔MSCs共培養(yǎng),在體外構建組織工程化軟骨.并通過組織染色、電鏡觀察了解細胞在同種異體骨基質明膠上粘附、生長和合

4、成分泌軟骨基質成分的情況.(6)制備兔膝關節(jié)軟骨全層缺損模型,以5'-溴-2'-脫氧尿嘧啶標記的組織工程化軟骨移植修復缺損區(qū),同時設缺損模型自行修復組、單純骨基質明膠修復組和未經腺病毒感染骨髓基質干細胞復合骨基質明膠修復組進行對比.術后1月、3月取材,觀察關節(jié)面修復情況,了解修復組織中細胞的分化和其合成基質的情況.結論 (1)用密度梯度離心法從髓腔中分離得到的單個核細胞,體外培養(yǎng)后經流式細胞儀檢測表面標志證實為骨髓基質干細胞.分離獲得的