蝎毒多肽促進小鼠骨髓造血細胞增殖的作用及機制的研究.pdf

1、背景和目的:造血干細胞(Hemotopoietic stem cell，HSC)移植廣泛應(yīng)用于血液病治療的臨床實踐。到目前為止，HSC移植是首先通過注射細胞因子動員骨髓中的HSC釋放到血液中去，然后通過血細胞分離機分離獲得大量HSC用于移植。細胞因子在促進大量HSC釋放入外周血的同時，也可能引發(fā)一系列副作用，如免疫應(yīng)答、腫瘤耐藥、降低干細胞歸巢能力等；同時，由于細胞因子價格昂貴使得大量等待HSC移植的患者不得不放棄治療。能否尋找到一種天

2、然物質(zhì)替代細胞因子，或者與細胞因子聯(lián)合使用減輕HSC動員的副作用，是血液系統(tǒng)疾病領(lǐng)域研究的熱點之一。前期研究提示蝎毒多肽（Scorpion venom peptide，SVP）能夠增強帶瘤小鼠的免疫力，促進放療后小鼠外周WBC的增殖。本研究以小鼠骨髓造血細胞（Bone marrow cells，BMC）和研究造血系統(tǒng)功能常用的細胞株M-NFS-60細胞為對象，觀察了SVP對骨髓造血細胞促增殖作用，并探討了SVP發(fā)揮作用的可能機制及信號途

3、徑。
　　 材料和方法：
　　 1.材料
　　 1.1 SPF級BALB/C小鼠，雌雄不限，5-6周齡，體重(20±2)g。
　　 1.2細胞株: r-h-MCSF 依賴細胞株M-NFS-60（小鼠粒白血病細胞），購自美國ATCC公司（CRL-1838TM）。
　　 1.3 SVP:由本課題組分離純化，包括SVPⅣ、SVPA2、SVPA3、SVPA4、SVPA5、SVPⅡ3（以下簡稱Ⅳ、A2、A3

4、、A4、A5、Ⅱ3）。
　　 2.方法：
　　 2.1 SVPⅣ對小鼠骨髓細胞增殖、形態(tài)以及受體表達的影響:
　　 2.1.1 SVPⅣ對小鼠骨髓細胞增殖的作用觀察：采用甲基纖維素半固體集落培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠骨髓集落（colony-forming unit，CFU），實驗分為六組：空白對照組、細胞因子（IL-3+M-CSF）組、SVPⅣ低劑量組（SVPIV1μg/ml）、SVPⅣ高劑量組（SVPIV3μg/ml）、S

5、VPⅣ低劑量+細胞因子（IL-3+M-CSF）組、SVPⅣ高劑量+細胞因子（IL-3+M-CSF）組，在培養(yǎng)第7、11、14d觀察SVPⅣ以及SVPⅣ與細胞因子聯(lián)合使用對CFU的影響。
　　 2.1.2 小鼠集落細胞形態(tài)的觀察：采用瑞氏-吉姆薩染色觀察培養(yǎng)第7d時各組集落細胞形態(tài)。
　　 2.1.3 正常小鼠骨髓第14d集落細胞IL-3R熒光強度:小鼠骨髓細胞培養(yǎng)14d后，免疫熒光法檢測各組細胞表面IL-3R的熒光強度。

6、
　　 2.2 BALB/C小鼠體內(nèi)實驗觀察SVPⅣ對CD34+細胞數(shù)以及IL-3R和M-CSFR表達的影響: BALB/C小鼠被隨機分為四組：生理鹽水對照組、細胞因子（IL-3+M-CSF）組、SVPⅣ組（0.4mg/kg，半數(shù)致死量的1/10），SVPⅣ+細胞因子（IL-3+M-CSF）組。各組分別連續(xù)1d、3d、5d 腹腔注射生理鹽水、細胞因子和SVPⅣ，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測SVPⅣ對CD34+細胞數(shù)以及IL-3R和M-CS

7、FR表達的影響:
　　 2.2.1 SVPIV對骨髓造血細胞表面CD34+細胞數(shù)的影響。
　　 2.2.2 SVPIV對骨髓造血細胞表面IL-3R表達的影響。
　　 2.2.3 SVPIV對骨髓造血細胞表面M-CSFR表達的影響。
　　 2.3 SVP組分對M-NFS-60細胞STAT5蛋白磷酸化的影響：SVP組分處理M-NFS-60細胞，用Western blotting方法檢測JAT-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

8、途徑中STAT5蛋白磷酸化的水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.SVPⅣ對小鼠骨髓細胞增殖的作用觀察：甲基纖維素半固體集落培養(yǎng)第7d時，SVPⅣ低劑量組CFU數(shù)高于SVPⅣ高劑量組，在第11、14d，SVPⅣ高劑量組CFU數(shù)高于細胞因子組和SVPⅣ低劑量組，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各時間點SVPⅣ+細胞因子組CFU數(shù)均高于其它組，其中在第7d，SVPⅣ低劑量+細胞因子組達到組間最高值，在第11、14

9、d時，SVPⅣ高劑量+細胞因子組達到組間最高值，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　 2.SVPⅣ對小鼠骨髓細胞形態(tài)的觀察：集落細胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示，除了空白對照組，其余各組細胞類型均以粒-單核細胞為主。
　　 3.正常小鼠骨髓第14天集落細胞IL-3R熒光強度：免疫熒光顯示，骨髓集落細胞培養(yǎng)14天后，與空白對照組相比，SVPⅣ低劑量組、SVPⅣ高劑量組、SVPⅣ低劑量+細胞因子組集落細胞增多且IL-

10、3R的熒光強度較對照組增強。
　　 4.SVPIV對骨髓造血細胞表面CD34+細胞數(shù)的影響：注射1d后，SVPⅣ+細胞因子組CD34+細胞數(shù)升至最高，其次是SVPⅣ組，細胞因子組和生理鹽水對照組；注射3d后，SVPⅣ+細胞因子組CD34+細胞數(shù)有所下降，但仍高于其它各組，SVPⅣ組CD34+細胞數(shù)與第1d相比無變化，細胞因子組CD34+細胞數(shù)略微升高；注射5d后，SVPⅣ+細胞因子組CD34+細胞數(shù)較第3d時略微下降，但仍高于其

11、它各組，然后依次是SVPⅣ組、細胞因子組和對照組。
　　 5.SVPIV對骨髓造血細胞表面IL-3R表達的影響：注射1d后，SVPⅣ+細胞因子組和SVPⅣ組IL-3R表達水平未見差異，且高于細胞因子組和生理鹽水對照組；注射3d后，SVPⅣ組骨髓細胞IL-3R表達水平升至最高，細胞因子組和SVPⅣ+細胞因子組骨髓細胞IL-3R表達水平相等，較第1d均有所上升；注射5d后，SVPⅣ組骨髓細胞IL-3R表達水平繼續(xù)升高，高于其它各組，

12、然后依次是SVPⅣ+細胞因子組、細胞因子組、生理鹽水對照組。
　　 6.SVPIV對骨髓造血細胞表面M-CSFR表達的影響：注射1d后，細胞因子組細胞表面M-CSFR表達水平較其它各組升高，其它各組細胞M-CSFR表達水平未見差異。注射5d后，SVPⅣ+細胞因子組細胞M-CSFR表達高于其它各組，其它各組M-CSFR表達水平相等。
　　 7.SVP組分對M-NFS-60細胞STAT5蛋白磷酸化的影響：SVP組分處理M-N

13、FS-60細胞后，STAT5蛋白磷酸化的水平與對照組相比明顯升高。
　　 綜上所述，SVP可促進小鼠骨髓造血集落的生成和CD34+細胞的增殖，并上調(diào)骨髓細胞IL-3R和M-NFS-60細胞STAT5蛋白磷酸化的水平，提示SVP促進小鼠造血細胞的增殖可能與細胞因子受體轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1．SVPⅣ在體外能夠促進小鼠骨髓造血集落的形成，與細胞因子聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同促增殖作用；SVPⅣ在體內(nèi)能夠促進