AML1a在小鼠造血細(xì)胞增殖分化異常中的作用.pdf

1、細(xì)胞的增殖分化受到嚴(yán)格調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)細(xì)胞中多種基因的表達(dá)是其中重要的調(diào)控機(jī)制。造血細(xì)胞的增殖失控、分化能力的喪失將可能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及白血病的發(fā)生。因此，闡明轉(zhuǎn)錄因子的功能對于確定細(xì)胞增殖分化調(diào)控機(jī)制以及在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用具有重要意義。AML1也稱之為PEBP2αB、CBFα2或RUNX1，是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。它在造血細(xì)胞中普遍表達(dá)，調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的分化和增殖。
　　 RUNX1/AML1通過選擇性剪接產(chǎn)生至少三

2、種異構(gòu)體：AML1a、AML1b和AML1c。其中，AML1b與AML1c僅在氨基末端存在27個氨基酸殘基的差異，均具有兩個主要的功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，兩者的功能基本相同，即我們通常所說的AML1。AML1a具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但缺少轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，因此通常被認(rèn)為不具有轉(zhuǎn)錄激活功能，但由于其具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可以與AML1b/1c競爭結(jié)合靶基因的DNA結(jié)合位點，導(dǎo)致靶基因不能正常轉(zhuǎn)錄，提示AML1a可能干擾

3、AML1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。有證據(jù)表明，AML1a在急性髓系白血病(AML)中表達(dá)高于正常對照。我們的前期實驗也已證實AML1a在急性白血病(AL)中的高表達(dá)，而且，AML1a可以抑制由AML1b介導(dǎo)的M-CSF受體(M-CSFR)啟動子的轉(zhuǎn)錄，提示AML1a對AML1b具有拮抗作用。為了進(jìn)一步研究AML1a在造血及白血病發(fā)病中的作用并探討其作用機(jī)制，本文完成了下列研究工作：
　　 1．AML1a表達(dá)載體的構(gòu)建及病毒的制備
　

4、　 pMSCV-FLAG-AML1a-IRES-YFP質(zhì)粒，將此質(zhì)粒和pMSCV-IRES-YFP分別與輔助質(zhì)粒pVPack-Eco（含Env）、pVPack-GP（含gal-pol）組合，通過磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，制備逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒感染3T3細(xì)胞，檢測病毒滴度，并測定AML1a的表達(dá)情況。結(jié)果顯示在感染的細(xì)胞中證實有AML1a和YFP的表達(dá)，所制備的病毒滴度滿足后續(xù)實驗的要求。
　　 2．AML1a在小鼠造血細(xì)胞增

5、殖分化異常及惡性轉(zhuǎn)化中的作用
　　 1)C57雄性小鼠的骨髓單個核細(xì)胞(BMMNCs)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)AML1a及空白對照后，置于含mSCF、mIL-3、mIL-6的M5300液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并接種于M3434甲基纖維素完全培養(yǎng)基進(jìn)行集落形成實驗。長期培養(yǎng)試驗中，AML1a組細(xì)胞形態(tài)顯示分化阻滯，而對照組細(xì)胞則處于更成熟的階段。集落形成實驗顯示轉(zhuǎn)導(dǎo)了AML1a的BMMNCs集落形成能力增強(qiáng)，集落體積明顯大于對照組，集落構(gòu)

6、成方面以CFU-E和CFU-GEMM為主，提示AML1a阻滯小鼠造血干祖細(xì)胞于較早的發(fā)育階段，并增加了造血干祖細(xì)胞的增殖能力。
　　 2)將轉(zhuǎn)導(dǎo)AML1a的C57小鼠的骨髓單個核細(xì)胞，尾靜脈注射至致死劑量照射的C57雌性小鼠體內(nèi)，單一轉(zhuǎn)導(dǎo)YFP的小鼠作為對照。定期尾靜脈取血，查血象及白細(xì)胞分類。轉(zhuǎn)導(dǎo)AML1a的小鼠尚未出現(xiàn)典型的白血病表型。
　　 綜上所述，本研究通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)AML1a至小鼠BMMNCs中，發(fā)現(xiàn)AM