胚胎期造血細(xì)胞分化潛能分析與內(nèi)皮祖細(xì)胞動員劑研究.pdf

1、第一部分：
　　哺乳動物造血的發(fā)生與發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的過程,具有嚴(yán)格的時(shí)空特異性,在胚胎發(fā)育過程中造血位點(diǎn)出現(xiàn)于不同的解剖部位,分別為原始造血和永久造血。原始造血最早是由出現(xiàn)于胚胎第7天(E7.0)的卵黃囊(YS)“血島”產(chǎn)生原始紅細(xì)胞,和成年人的紅血胞在大小形狀、基因表型、細(xì)胞激素需求上有差別。但永久造血起源于何處仍存在爭議,目前主流認(rèn)為胚胎初生造血干細(xì)胞(HSCs)是多個(gè)造血位點(diǎn)共同起源,即卵黃囊和胚體的P-Sp/AGM區(qū),

2、還有認(rèn)為尿囊和胎盤也可能是發(fā)生部位,隨后遷移至胎肝大量擴(kuò)增。研究表明卵黃囊也可產(chǎn)生永久造血干/祖細(xì)胞,但由于微環(huán)境和其他可能的原因,卵黃囊來源的造血干/祖細(xì)胞自我更新能力弱,分化能力強(qiáng),數(shù)量迅速減少。因此,卵黃囊造血表現(xiàn)為胚胎發(fā)育過程中第一波的短暫性造血,并不是隨后發(fā)生的胎肝和骨髓造血的主要來源。近期的一系列研究表明,在E8.25的卵黃囊造血中可以檢測出胚胎發(fā)育過程中第一波的一過性造血,隨著循環(huán)系統(tǒng)的形成,在胚體其他部位也出現(xiàn)造血細(xì)胞,

3、E8.5的主動脈旁臟層(P-Sp)也出現(xiàn)一波短暫性造血;真正具有長期重建各系造血功能的HSC出現(xiàn)在E10.0的胚內(nèi)AGM區(qū),并且進(jìn)一步定位在其中的背主動脈(dorsalaorta,DA)。隨后,在胚胎其他的大血管,如卵黃囊動脈以及臍動脈中也發(fā)現(xiàn)有造血前體細(xì)胞,而且在上述動脈管壁內(nèi)可見造血細(xì)胞簇。由于血液循環(huán)系統(tǒng)的建立,定位胚胎期產(chǎn)生的造血干細(xì)胞的發(fā)生位點(diǎn)是個(gè)非常復(fù)雜的過程,在研究中,使用合適的胚胎期造血細(xì)胞的標(biāo)志成為研究的關(guān)鍵點(diǎn)之一。<

4、br>　　CD41,又稱αIIb整合素,是眾所周知的巨核細(xì)胞和血小板的特異性標(biāo)志,最近研究發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎發(fā)育過程中CD41的表達(dá)標(biāo)志著原始造血和永久造血的啟動發(fā)生,并且胚胎發(fā)育過程中CD41在YS“血島”,AGM區(qū)和胎盤中都有階段性表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞在發(fā)育過程中關(guān)系密切,目前的研究報(bào)道主要集中在CD41+細(xì)胞向造血分化潛能的研究,然而,小鼠胚胎時(shí)期CD41+細(xì)胞除造血之外的多向分化潛能尚未闡明清晰。因此,我們擬通過流式細(xì)

5、胞儀分選胚胎11.0天(E11.0)的AGM區(qū),卵黃囊和胚胎循環(huán)血(CB)中的CD41+細(xì)胞,并研究其向間質(zhì)細(xì)胞分化的潛能,為研究胚胎造血發(fā)育調(diào)控奠定良好的基礎(chǔ)。首先我們在體外半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行CD41+細(xì)胞造血分化潛能研究,AGM區(qū)、YS和CB來源的CD41+細(xì)胞生成造血各譜系的能力有一定差異;隨后主要在體內(nèi)外研究了CD41+細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞分化的潛能:(1)體外建立間質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)體系,探討小鼠胚胎發(fā)育過程中AGM區(qū)、YS和CB來源的CD

6、41+細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞分化潛能;(2)建立一個(gè)體內(nèi)評價(jià)CD41+細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞分化的動物模型,分選GFP轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎發(fā)育過程中AGM區(qū)、YS和CB來源的GFP+CD41+細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植,通過免疫熒光檢測間質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志vimentin、α-SMA、epimorphin(EPM)的表達(dá)情況來評估其向間質(zhì)細(xì)胞分化能力;(3)根據(jù)CD41表達(dá)強(qiáng)弱分析和探討CD41+細(xì)胞中具有間質(zhì)細(xì)胞分化潛能的細(xì)胞亞群。我們體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AGM區(qū)的CD41+

7、細(xì)胞形成的貼壁的成纖維樣間質(zhì)細(xì)胞增殖能力較強(qiáng),至少能擴(kuò)增5-6代;YS來源的CD41+細(xì)胞也能生成貼壁的成纖維樣間質(zhì)細(xì)胞,但其只能擴(kuò)增1-2代,增殖能力較弱;CB來源的CD41+細(xì)胞只有很少一部分能生成貼壁的成纖維樣間質(zhì)細(xì)胞,大多都是圓形不貼壁的造血細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果表明,無論AGM區(qū)還是YS來源的成纖維樣間質(zhì)細(xì)胞都表達(dá)成纖維母細(xì)胞標(biāo)志vimentin和α-SMA,而CB中只有極少量的甚至無vimentin和α-SMA的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通

8、過建立半致死劑量輻射損傷小鼠模型,移植GFP+CD41+細(xì)胞后,從第二周開始直至第四周,檢測受體小鼠外周血中GFP表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)來源的GFP+CD41+細(xì)胞造血重建能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于YS和CB來源的GFP+CD41+細(xì)胞,YS來源的GFP+CD41+細(xì)胞呈現(xiàn)短暫性造血重建;檢測受體骨髓中GFP+CD45+嵌合情況,發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)來源的GFP+CD41+細(xì)胞能歸巢到受體骨髓進(jìn)行造血重建,而YS和CB來源的GFP+CD41+細(xì)胞很少歸巢至骨

9、髓。與此同時(shí),我們在AGM區(qū)和YS來源的GFP+CD41+細(xì)胞移植組小鼠肺部切片中發(fā)現(xiàn)有GFP+細(xì)胞,并沿著血管外周形成管腔樣結(jié)構(gòu),對這些GFP+細(xì)胞的進(jìn)一步鑒定表明其表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志vimentin/α-SMA/EPM,并還檢測到有少部分細(xì)胞表達(dá)造血/內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31+,而在CB來源的GFP+CD41+細(xì)胞移植小鼠肺部并沒有發(fā)現(xiàn)GFP+細(xì)胞的分布。為了進(jìn)一步確定CD41+細(xì)胞中具有間質(zhì)分化潛能的細(xì)胞亞群,我們根據(jù)CD41表達(dá)強(qiáng)弱,

10、流式分選出AGM區(qū)和YS來源的CD41int和CD41high亞群進(jìn)行體外間質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化,研究表明AGM區(qū)和YS來源的CD41+細(xì)胞中具有間質(zhì)細(xì)胞分化潛能的一群細(xì)胞主要在CD41int中。隨后又對AGM區(qū)和YS來源的CD41int做了進(jìn)一步鑒定研究,聯(lián)合利用CD34標(biāo)志雙色分選出CD41intCD34-和CD41intCD34+細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)AGM區(qū)來源CD41intCD34-細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞分化能力,而CD41intCD34+細(xì)胞未觀察

11、到間質(zhì)分化潛能;YS來源CD41intCD34-細(xì)胞和CD41intCD34+細(xì)胞都具有間質(zhì)細(xì)胞分化潛能。
　　綜上所述,我們的研究初步表明:(1)AGM區(qū)、YS和CB來源的CD41+細(xì)胞體外除了能向造血各譜系分化外,在體內(nèi)外一定條件下,還能向間質(zhì)細(xì)胞分化,且AGM區(qū)來源的CD41+細(xì)胞形成的間質(zhì)細(xì)胞增殖能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于YS和CB來源的CD41+細(xì)胞。(2)體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)中,只有AGM區(qū)和YS來源的CD41+具有間質(zhì)分化能力,且AGM區(qū)

12、來源的CD41+細(xì)胞造血重建能力強(qiáng)于YS和CB來源的CD41+細(xì)胞。(3)AGM區(qū)和YS來源的CD41+細(xì)胞中具有間質(zhì)細(xì)胞分化潛能的一群細(xì)胞主要在CD41int中。聯(lián)用CD34標(biāo)志雙標(biāo)分選出CD41intCD34-和CD41intCD34+細(xì)胞中,AGM區(qū)來源的CD41intCD34-細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞分化能力,而CD41intCD34+細(xì)胞未觀察到;YS來源的CD41intCD34-細(xì)胞和CD41intCD34+細(xì)胞都具有間質(zhì)細(xì)胞分化潛

13、能。
　　第二部分:
　　缺血性疾病是一類嚴(yán)重威脅人類健康和生存質(zhì)量的疾病,包括心腦血管缺血和嚴(yán)重肢體缺血損傷。目前,臨床治療手段主要包括藥物治療、血管旁路重建、血管腔內(nèi)成形或支架術(shù)等,治療方法無實(shí)質(zhì)性改進(jìn),療效也不理想?！爸委熜匝苄律?therapeutic neovascularization)的提出為缺血性疾病的治療提出新策略,應(yīng)用內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)植入

14、術(shù)可促進(jìn)缺血組織的血管新生和側(cè)枝循環(huán)形成,增強(qiáng)血流灌注,治療缺血性疾病。外周血中EPCs是同時(shí)表達(dá)Sca-1和Flk-1表面標(biāo)志的一群可向血管內(nèi)皮分化的高增殖潛能前體細(xì)胞,可替代凋亡或壞死的內(nèi)皮細(xì)胞,參與損傷后的血管新生。通過外源性移植EPCs可促進(jìn)缺血心肌和肢體骨骼肌血管的新生。近年來的研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞動員藥物對治療缺血性疾病有一定的療效,可動員自體骨髓中的干細(xì)胞到損傷組織,促進(jìn)血管新生、恢復(fù)缺血組織功能,為缺血性疾病的治療提供了新的思

15、路。
　　干細(xì)胞動員過程復(fù)雜,SDF-1α/CXCR4軸在骨髓干細(xì)胞的遷移與歸巢中發(fā)揮重要的作用。SDF-1α的趨化作用由其受體CXCR4介導(dǎo)。骨髓中HSCs和EPCs高表達(dá)CXCR4,基質(zhì)細(xì)胞分泌SDF-1α對此類細(xì)胞具有趨化作用。干細(xì)胞歸巢與動員是個(gè)互為鏡像的動態(tài)過程。通過擾動SDF-1α/CXCR4軸可大量動員骨髓干細(xì)胞進(jìn)入外周血。缺血、缺氧及組織損傷等病理變化均可使缺血損傷組織SDF-1α的分泌顯著增強(qiáng),形成SDF-1α濃

16、度梯度差,骨髓中高表達(dá)CXCR4的EPCs能夠沿著SDF-1α的濃度梯度遷移至損傷部位參與修復(fù)。但正常外周血中EPCs數(shù)量很低,這種代償性的EPCs動員過程不足以用來修復(fù)損傷組織,通過干細(xì)胞動員藥物則能打破這一限制,大量動員骨髓中EPCs并遷移至缺血組織,促進(jìn)血管新生,恢復(fù)缺血組織功能。目前研究發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子包括G-CSF,GM-CSF,VEGF和雌二醇(estradiol),CXCR4拮抗劑AMD3100,及一氧化氮(NO)和血管生成

17、素(angiopoietin)均可不同程度動員骨髓干細(xì)胞進(jìn)入外周血。這些干細(xì)胞動員劑對內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員效果及促進(jìn)缺血組織恢復(fù)的能力還需進(jìn)一步改進(jìn),部分動員劑反復(fù)給藥會引發(fā)副作用。因此,研發(fā)新型、高效、無毒副作用的干細(xì)胞動員劑成為研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。
　　本研究中,我們首次研究發(fā)現(xiàn)了一種飽和胺類小分子化合物Me6可持續(xù)大量動員EPCs,促進(jìn)缺血組織血管的新生,對下肢缺血性疾病的修復(fù)具有一定的作用。我們研究證明Me6皮下給藥后小鼠的外周

18、血和脾臟中Sca-1+Flk-1+細(xì)胞含量均顯著增加。Me6在給藥12h后的通過流式檢測顯示外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞Sca-1+Flk-1+比例是正常血中的3倍(Me61.98±0.13％vs.vehicle control 0.71±0.09%),統(tǒng)計(jì)分析與對照組間存在顯著性差異(**p<0.01),直至72h后外周血中Sca-1+Flk-1+比例恢復(fù)正常。脾臟具有募集內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能,同時(shí)在此作用時(shí)間點(diǎn),脾臟中這群Sca-1+Flk-1+

19、細(xì)胞(Me67.33±0.71%vs.vehiclecontrol3.3±0.37%)的比例也上調(diào),統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與正常對照組的脾臟中內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**p<0.01)。流式檢測外周血還發(fā)現(xiàn)Me6還能顯著上調(diào)CD34的表達(dá)(Me619.5±1.4vs.vehicle control 14.8±0.76),而間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志并沒有明顯變化,CD29有輕微上調(diào),CD105沒有變化。
　　為進(jìn)一步評估Me6動員的EPCs促進(jìn)

20、缺血下肢損傷修復(fù)的功能,我們建立了小鼠下肢缺血模型,將Me6或PBS處理小鼠的外周血單個(gè)核細(xì)胞移植到小鼠下肢缺血損傷肌肉組織中,應(yīng)用激光多普勒(LDPI)指數(shù)(由缺血下肢與正常下肢之比值來計(jì)算)經(jīng)行評估血流灌注恢復(fù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植了Me6給藥小鼠的外周血細(xì)胞能明顯促進(jìn)缺血下肢血流灌注的恢復(fù)。我們進(jìn)一步觀察了Me6對下肢缺血損傷小鼠的EPCs動員效果。建立小鼠下肢缺血模型在第7天給藥檢測各組外周血中Sca-1+Flk-1+比例(Me63

21、.09±0.5%;AMD31003.17±0.4%;vehicle control 1.49±0.1%),發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明Me6能有效動員下肢缺血損傷小鼠骨髓中的EPCs至外周血中。進(jìn)一步研究結(jié)果證明Me6能直接動員自體骨髓中的EPCs進(jìn)入外周血,進(jìn)而被募集到缺血損失組織,分化為血管內(nèi)皮參與血管新生。對下肢缺血損傷小鼠皮下注射Me6后的治療效果觀察中發(fā)現(xiàn),經(jīng)Me6治療的小鼠,其缺血損傷的下肢血流灌注得到了很好的恢復(fù),新生血管數(shù)量顯著高于對照