人卵黃囊內(nèi)皮細胞對臍血造血干-祖細胞擴增的研究.pdf

1、目的：臍血造血干/祖細胞(hematopoietic stem/progenitor。cells,HS/PCs)體外擴增是解決造血干細胞移植供者來源困難的有效方法之一,也是造血干細胞移植研究的熱點。目前,體外擴增造血細胞的方法主要有細胞因子擴增和飼養(yǎng)層細胞擴增。本研究從4-5周人卵黃囊中培養(yǎng)出內(nèi)皮細胞,聯(lián)合細胞因子對臍血造血干/祖細胞的體外擴增作用進行研究,并對其擴增機制進行初步探討。 方法：在中南大學倫理委員會指導下,

2、病人獲得知情同意后,獲取4-5周妊囊,從卵黃囊中分離純化內(nèi)皮樣細胞,免疫化學法檢測其內(nèi)皮細胞特異性抗原的表達。利用該內(nèi)皮細胞聯(lián)合細胞因子,分3組體外擴增臍血CD34<'+>細胞:①因子組:CD34<'+>細胞2×10<'4>個/m1+擴增培養(yǎng)基;②非接觸培養(yǎng)組:CD34<'+>細胞2×10<'4>個/ml+擴增培養(yǎng)基+millicell膜+人卵黃囊內(nèi)皮細胞;③接觸培養(yǎng)組:CD34<'+>細胞2×10<'4>個/m1+擴增培養(yǎng)基+人卵黃囊

3、內(nèi)皮細胞,每組復4孔接種于24孔板。體外培養(yǎng)7天后,從細胞總數(shù),CD34<'+>細胞數(shù),高增殖潛能集落形成細胞數(shù)和紅系/粒單系集落數(shù)方面比較各組的擴增效率。利用RT-PCR檢測Notch信號通路在人卵黃囊內(nèi)皮細胞和擴增的造血細胞的表達。 結(jié)果： 一.從4-5周人卵黃囊中培養(yǎng)出的內(nèi)皮樣細胞具有典型內(nèi)皮細胞的特點 卵黃囊細胞培養(yǎng)24小時后,部分細胞貼壁,3-4天后形成由40一50個大小均一細胞組成的集

4、落,呈多角形,單層鋪路石樣排列。機械方法傳代后的細胞能再次形成均一的集落。生長狀態(tài)良好的細胞能形成條索樣結(jié)構(gòu),在Matrigel上能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。取第3代人卵黃囊內(nèi)皮細胞檢測,CD31為強陽性,vWF和VE-Cadherin(CD144)為陽性。對照的人骨髓成纖維細胞上述抗原均為陰性。因此,來源于4-5周人卵黃囊的內(nèi)皮樣細胞符合典型的內(nèi)皮細胞形態(tài),并表達成熟內(nèi)皮細胞特異性抗原CD31、vWF和CD144。 二.與人卵黃囊內(nèi)皮細胞

5、接觸培養(yǎng)能明顯促進臍血中高增殖潛能集落形成細胞(high potential proliferation-colony forming cells,HPP-CFCs)的擴增 流式細胞計數(shù)結(jié)果顯示,接觸培養(yǎng)組中的細胞總數(shù)擴增倍數(shù)達52.35±7.28倍,明顯高于因子組24.08±4.31倍(P<0.05)和非接觸培養(yǎng)組25.75±4.02倍(P<0.05),三組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 CD34<'+

6、>細胞數(shù)接觸培養(yǎng)組擴增7.58±1.08倍，因子組擴增4.61±0.68倍，非接觸培養(yǎng)組擴增4.39±1.12倍，三組間差異無統(tǒng)計學意義。高增殖潛能集落形成細胞檢測的結(jié)果顯示，三組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，HPP-CFC的擴增倍數(shù)以接觸培養(yǎng)組為最高，達20.26±1.87倍，明顯高于因子組5.31±1.83倍(P<0.05)和非接觸培養(yǎng)組6.36±2.53倍(P<0.05)。這說明與人卵黃囊內(nèi)皮細胞接觸培養(yǎng)能促進臍血造血干／

7、祖細胞的擴增，尤其是高增殖潛能集落形成細胞的擴增。 三、與人卵黃囊內(nèi)皮細胞接觸培養(yǎng)能明顯促進臍血早期紅系祖細胞(erythroid burst-forming units，BFU-E)的擴增 接觸培養(yǎng)組早期紅系祖細胞BFU-E擴增27.77±5.77倍，明顯強于因子組7.14±0.99倍(P<0.05)和非接觸培養(yǎng)組11.02±3.31倍(P<0.05)，三組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；晚期紅系祖細胞CFU-E

8、接觸培養(yǎng)組擴增17.19±4.27倍，因子組擴增7.93±2.74倍，非接觸培養(yǎng)組擴增9.12±1.49倍，三組間差異無統(tǒng)計學意義；CFU-GM接觸培養(yǎng)組擴增17.14±4.04倍強于因子組6.67±1.13倍和非接觸培養(yǎng)組10.51±0.89倍，但三組間差異無統(tǒng)計學意義。這說明與人卵黃囊內(nèi)皮細胞接觸培養(yǎng)能促進臍血早期紅系祖細胞BFU-E的擴增。 四、Notch受體和配體mRNA在臍穩(wěn)血CD34<'+>細胞和人卵黃囊內(nèi)皮細胞的表

9、達 利用RT-PCR檢測Notch受體和配體mRNA的表達情況，臍血CD34<'+>細胞表達Notch受體Notchl，Notch2：未與臍血CD34<'+>細胞接觸培養(yǎng)的人卵黃囊內(nèi)皮細胞不表達Notch的配體Jaggedl，Jagged2，Deltal，DeIta4，但與臍血CD34<'+>細胞接觸培養(yǎng)7天后的人卵黃囊內(nèi)皮細胞能表達Notch的配體Jagged2，Deltal和Delta4。 結(jié)論： (1)從4

10、-5周人卵黃囊中培養(yǎng)出的內(nèi)皮細胞符合典型的內(nèi)皮細胞形態(tài)，能自發(fā)形成線性結(jié)構(gòu)，在Matrigel上能形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并表達成熟內(nèi)皮細胞相關(guān)抗原CD31、CDl44和vWF。 (2)首次報道人卵黃囊內(nèi)皮細胞擴增臍血造血干／祖細胞的擴增體系——人卵黃囊內(nèi)皮細胞聯(lián)合細胞因子IL-3、IL-6、SCF和GM-CSF，與臍血CD34<'+>細胞接觸培養(yǎng)，能促進臍血造血細胞體外擴增，尤其是代表原始造血細胞的高增殖潛能集落形成細胞(HPP-CFC

11、)和早期紅系祖細胞(BFU-E)有顯著擴增。 (3)與臍血CD34<'+>細胞接觸培養(yǎng)7天后的人卵黃囊內(nèi)皮細胞表達Notch的配體Jagged2，Deltal和Delta4，和臍血CD34<'+>細胞表達的Notch受體Notchl，2結(jié)合啟動Notch信號，這可能是人卵黃囊內(nèi)皮細胞與臍血CD34<'+>細胞接觸培養(yǎng)明顯促進臍血原始造血細胞的高增殖潛能集落形成細胞(HPP-CFC)和原始的紅細胞系祖細胞(BFU-E)體外擴增的原