臍血造血干-祖細(xì)胞分離、純化、生物學(xué)特性及B細(xì)胞分化發(fā)育研究.pdf

1、研究目的： 探討密度分離臍血造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增和體內(nèi)重建造血的潛能；胎兒骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增的造血支持作用；體外誘導(dǎo)臍血造血干/祖細(xì)胞向B細(xì)胞分化發(fā)育的規(guī)律。 研究?jī)?nèi)容： (1)利用造血干/祖細(xì)胞培養(yǎng)、體外擴(kuò)增、移植動(dòng)物模型等技術(shù)，研究不同比密Ficoll-泛影葡胺分離液分離臍血造血干/祖細(xì)胞的造血活性。 (2)體外分離、純化胎兒骨髓間質(zhì)干細(xì)胞：Mini—MACS免疫磁珠分離臍血CD

2、34+細(xì)胞；建立胎兒骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞因子與CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)體系，用液體培養(yǎng)方法擴(kuò)增細(xì)胞；實(shí)時(shí)定量RT—PCR技術(shù)分析培養(yǎng)細(xì)胞的nucleostemin基因表達(dá)。 (3)體外免疫磁珠分離純化臍血造血干/祖細(xì)胞；在小鼠S—17基質(zhì)細(xì)胞支持下，臍血造血干/祖細(xì)胞、T3、IL7共培養(yǎng)建立體外B細(xì)胞分化發(fā)育培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)臍血造血干/祖細(xì)胞B細(xì)胞分化；用流式細(xì)胞儀、PCR、RT—PCR技術(shù)檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間分化的B細(xì)胞。 研究

3、方法： (1)密度分離臍血細(xì)胞配制不同密度Ficoll—泛影葡胺細(xì)胞分離液，分別應(yīng)用密度為1.054 g/ml、1.064g/ml、1.072g/ml、1.077g/ml、1.084g/mlFicoll—泛影葡胺不連續(xù)密度梯度離心分離臍血有核細(xì)胞成分。 (2)造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)五種不同比密Ficll—泛影葡胺分離液分離的臍血細(xì)胞，在甲基纖維素體系中培養(yǎng)測(cè)定其集落形成能力。CFU—GM體系含有細(xì)胞2×105/ml，20％F

4、BS，20ng/ml GM—CSF，0.9％甲基纖維素。BFU—E體系含有細(xì)胞2×105/ml，10-5M2-巰基乙醇，3mM L-谷氨酰胺，馬血清25％，白細(xì)胞條件培養(yǎng)液20％，EPO2U/ml，0.9％甲基纖維素。充分混勻以每孔0.25ml加入24孔培養(yǎng)板中，重復(fù)2孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，CFU—GM培養(yǎng)7天，BFU—E培養(yǎng)14天，倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)CFU—GM，BFU—E。鑒別標(biāo)準(zhǔn)：CFU—GM每個(gè)集落至少含有40個(gè)

5、細(xì)胞；BFU—E集落呈多中心狀，橘紅色，至少含有100個(gè)細(xì)胞。 (3)密度分離細(xì)胞的生物學(xué)特性分析BALB/c照射小鼠體內(nèi)輸注不同比密Ficoll—泛影葡胺分離液分離的臍血細(xì)胞，觀察其造血潛能。Ficoll—泛影葡胺分離液分離的細(xì)胞，用無(wú)菌生理鹽水洗滌二次后，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml，小鼠經(jīng)致死劑量(8.5Gy)照射后隨機(jī)分為3組，照射后2小時(shí)完成輸注。Ⅰ組6只，輸注無(wú)菌生理鹽水0.2ml；Ⅱ組6只，輸注經(jīng)1.077

6、g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離洗滌后的臍血MNC(1.077細(xì)胞)0.2ml；Ⅲ組6只，輸注經(jīng)1.064g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離洗滌后的臍血MNC(1.064細(xì)胞)0.2ml。所有小鼠均采用尾靜脈輸注。 (4)臍血造血干/祖細(xì)胞體外擴(kuò)增 取經(jīng)鑒定的MSCs接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80％匯合度時(shí)，接種MiniMACS分選的CD34+細(xì)胞(4000/孔)，總體積為1ml，共分4組(每組3孔

7、)：①CD34+細(xì)胞組；②胎兒骨髓MSCs+CD34+細(xì)胞組；③細(xì)胞因子+CD34+細(xì)胞組，細(xì)胞因子濃度為50ng/ml SCF、50ng/ml IL—3、50ng/ml FL、50ng/ml TPO；④胎兒骨髓MSCs+細(xì)胞因子+CD34+細(xì)胞組。培養(yǎng)體系為含10％FBS的DMEM，置5％CO2、飽和濕度37℃培養(yǎng)。每7天半量換液1次并補(bǔ)充新的細(xì)胞因子，濃度同前。 (5)臍血造血干/祖細(xì)胞B細(xì)胞分化培養(yǎng) 接種Dynal

8、 beads分選的CD34+CD19—細(xì)胞或細(xì)胞儀分選的CD34+CD19—CD38—細(xì)胞于預(yù)鋪S—17基質(zhì)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)體系為α—MEM培養(yǎng)液，含3％FBS，50μM2—巰基乙醇，1％L—谷氨酰胺、T3及細(xì)胞因子組合，每孔總體積100μl。置5％CO2，飽和濕度，37℃培養(yǎng)。每7天半量換液1次并補(bǔ)充新的細(xì)胞因子，濃度同前。 (6)流式細(xì)胞分析術(shù)分選或培養(yǎng)的1×106細(xì)胞標(biāo)記前用含1％牛血清白蛋白(HAS)的PBS洗

9、滌1次，用熒光標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體標(biāo)記，置4℃條件下30 min，用含1％HAS的PBS洗滌1次，加0.4 m1含0.1％疊氮鈉的PBS，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。分析軟件為Cellquest。 (7)CD34+細(xì)胞nucleostemi力基因表達(dá)的分析定量PCR反應(yīng)用于nucleostemin基因分析。反應(yīng)體系為25μl，包括：1μlcDNA模板和24μl反應(yīng)混合液[其中含2.5mM MgCl2，20pmol引物，0.1μl Sybe

10、r greenⅠ(1：1000)]。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性2min，(94℃30s，58℃30s，72℃30s)，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH內(nèi)參照，擴(kuò)增長(zhǎng)度為205 bp，GAPDH基因連于pMD—18T載體定量稀釋，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。每個(gè)DNA樣品做2個(gè)平行管，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束后使用定量PCR儀的分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算各樣本基因的原始拷貝數(shù)，單位為拷貝/μ lcDNA。Nucleostemin PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與

11、相應(yīng)GAPDH的擴(kuò)增產(chǎn)物原始拷貝數(shù)的比值能反映轉(zhuǎn)錄水平的差異。 此外，采取上述方法(PCR或RT—PCR)分析T3Rα1、T3Rα2、hT3Rβ1、Iμ、Cμ、IgLL、DQ52(D7-27)、DXP1(D3—9)、DQ52/DXP1等基因的表達(dá)、重組情況。 研究結(jié)果： (1)1.064g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離臍血細(xì)胞中，CFU—GM集落數(shù)為373±289/1×105MNC，BFU—E為121±

12、70/1×105MNC；在細(xì)胞因子刺激下，1.064g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離臍血MNC在體外擴(kuò)增14天時(shí)CFU—GM的擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)52.2倍；1.064g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離的造血干/祖細(xì)胞可在8.5Gy致死劑量照射小鼠體內(nèi)植入，輸注1.064g/ml Ficoll分離臍血MNC產(chǎn)生的脾結(jié)節(jié)數(shù)是輸注1.077g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離臍血MNC的2.2倍。 (2)胎兒骨髓間質(zhì)干

13、細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44；免疫磁珠分選CD34+細(xì)胞的平均純度為97.4％；胎兒骨髓間質(zhì)干細(xì)胞+CD34+細(xì)胞共培養(yǎng)28天，CD34+細(xì)胞仍占有核細(xì)胞的6.43％；CD34+細(xì)胞在胎兒骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、細(xì)胞因子作用下培養(yǎng)28天，有核細(xì)胞總數(shù)、CD34+細(xì)胞數(shù)分別被擴(kuò)增1.65×105倍、788倍。 (3)T3誘導(dǎo)臍血造血干/祖細(xì)胞B細(xì)胞分化，在我們選用的實(shí)驗(yàn)條件下，T3、IL—7與小鼠S—17基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)是誘導(dǎo)CD34+CD1

14、9—造血干/祖細(xì)胞向B細(xì)胞分化的最佳條件，誘導(dǎo)的CD19+B部分細(xì)胞表達(dá)CD21，還表達(dá)CD10、CD20、CD24抗原，弱表達(dá)CD23抗原、HSL11、HSL96，不表達(dá)CD3、CD33、CD34、IgM抗原，B細(xì)胞向成熟方向發(fā)育；在小鼠S—17基質(zhì)細(xì)胞支持下，單純T3誘導(dǎo)的CD19+B細(xì)胞大多數(shù)體積較小，CD19+B細(xì)胞幾乎不表達(dá)CD21，B細(xì)胞發(fā)育停留在較原始階段；34+CD19—CD38—造血干/祖細(xì)胞B細(xì)胞分化的擴(kuò)增倍數(shù)明顯高

15、于34+CD19—造血干/祖細(xì)胞，持續(xù)擴(kuò)增的時(shí)間也延長(zhǎng)；新鮮臍血與凍存臍血CD34+CD19—造血干/祖細(xì)胞B細(xì)胞分化的純度、擴(kuò)增倍數(shù)無(wú)明顯差異；小鼠S—17基質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)T3Rα1，傳代20代以上小鼠S—17基質(zhì)細(xì)胞，失去支持臍血CD34+CD19—造血干/祖細(xì)胞B細(xì)胞分化的能力。 (4)純化的臍血CD34+CD19-造血干/祖細(xì)胞檢測(cè)到胚系DQ52基因，未發(fā)生DH-JH基因重排；誘導(dǎo)分化的B細(xì)胞優(yōu)先選擇DQ52-JH4、DQ

16、52-JH3、DQ52-JH5基因重排，未檢測(cè)到DQ52-JH、DQ52-JH2、DQ52-JH6基因重排；在整個(gè)B細(xì)胞分化發(fā)育過(guò)程中，我們檢測(cè)到持續(xù)的Iμ、Cμ、IgLL轉(zhuǎn)錄。 研究結(jié)論： (1)1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分離的造血干/祖細(xì)胞在體外具有較高的增殖、持續(xù)造血的能力及較強(qiáng)的體內(nèi)造血重建潛能。 (2)胎兒骨髓間質(zhì)干細(xì)胞可有效擴(kuò)增臍血造血干/祖細(xì)胞。 (3)T3、IL7與小鼠S-