臍血造血干-祖細胞分離、純化、生物學特性及B細胞分化發(fā)育研究.pdf

1、研究目的： 探討密度分離臍血造血干/祖細胞體外擴增和體內重建造血的潛能；胎兒骨髓間質干細胞對CD34+細胞體外擴增的造血支持作用；體外誘導臍血造血干/祖細胞向B細胞分化發(fā)育的規(guī)律。 研究內容： (1)利用造血干/祖細胞培養(yǎng)、體外擴增、移植動物模型等技術，研究不同比密Ficoll-泛影葡胺分離液分離臍血造血干/祖細胞的造血活性。 (2)體外分離、純化胎兒骨髓間質干細胞：Mini—MACS免疫磁珠分離臍血CD

2、34+細胞；建立胎兒骨髓間質干細胞、細胞因子與CD34+細胞共培養(yǎng)體系，用液體培養(yǎng)方法擴增細胞；實時定量RT—PCR技術分析培養(yǎng)細胞的nucleostemin基因表達。 (3)體外免疫磁珠分離純化臍血造血干/祖細胞；在小鼠S—17基質細胞支持下，臍血造血干/祖細胞、T3、IL7共培養(yǎng)建立體外B細胞分化發(fā)育培養(yǎng)體系，誘導臍血造血干/祖細胞B細胞分化；用流式細胞儀、PCR、RT—PCR技術檢測不同培養(yǎng)時間分化的B細胞。 研究

3、方法： (1)密度分離臍血細胞配制不同密度Ficoll—泛影葡胺細胞分離液，分別應用密度為1.054 g/ml、1.064g/ml、1.072g/ml、1.077g/ml、1.084g/mlFicoll—泛影葡胺不連續(xù)密度梯度離心分離臍血有核細胞成分。 (2)造血祖細胞集落培養(yǎng)五種不同比密Ficll—泛影葡胺分離液分離的臍血細胞，在甲基纖維素體系中培養(yǎng)測定其集落形成能力。CFU—GM體系含有細胞2×105/ml，20％F

4、BS，20ng/ml GM—CSF，0.9％甲基纖維素。BFU—E體系含有細胞2×105/ml，10-5M2-巰基乙醇，3mM L-谷氨酰胺，馬血清25％，白細胞條件培養(yǎng)液20％，EPO2U/ml，0.9％甲基纖維素。充分混勻以每孔0.25ml加入24孔培養(yǎng)板中，重復2孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，CFU—GM培養(yǎng)7天，BFU—E培養(yǎng)14天，倒置顯微鏡下觀察計數(shù)CFU—GM，BFU—E。鑒別標準：CFU—GM每個集落至少含有40個

5、細胞；BFU—E集落呈多中心狀，橘紅色，至少含有100個細胞。 (3)密度分離細胞的生物學特性分析BALB/c照射小鼠體內輸注不同比密Ficoll—泛影葡胺分離液分離的臍血細胞，觀察其造血潛能。Ficoll—泛影葡胺分離液分離的細胞，用無菌生理鹽水洗滌二次后，計數(shù)并調整細胞濃度為2×106/ml，小鼠經(jīng)致死劑量(8.5Gy)照射后隨機分為3組，照射后2小時完成輸注。Ⅰ組6只，輸注無菌生理鹽水0.2ml；Ⅱ組6只，輸注經(jīng)1.077

6、g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離洗滌后的臍血MNC(1.077細胞)0.2ml；Ⅲ組6只，輸注經(jīng)1.064g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離洗滌后的臍血MNC(1.064細胞)0.2ml。所有小鼠均采用尾靜脈輸注。 (4)臍血造血干/祖細胞體外擴增 取經(jīng)鑒定的MSCs接種于24孔板中，當細胞生長達80％匯合度時，接種MiniMACS分選的CD34+細胞(4000/孔)，總體積為1ml，共分4組(每組3孔

7、)：①CD34+細胞組；②胎兒骨髓MSCs+CD34+細胞組；③細胞因子+CD34+細胞組，細胞因子濃度為50ng/ml SCF、50ng/ml IL—3、50ng/ml FL、50ng/ml TPO；④胎兒骨髓MSCs+細胞因子+CD34+細胞組。培養(yǎng)體系為含10％FBS的DMEM，置5％CO2、飽和濕度37℃培養(yǎng)。每7天半量換液1次并補充新的細胞因子，濃度同前。 (5)臍血造血干/祖細胞B細胞分化培養(yǎng) 接種Dynal

8、 beads分選的CD34+CD19—細胞或細胞儀分選的CD34+CD19—CD38—細胞于預鋪S—17基質細胞的96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)體系為α—MEM培養(yǎng)液，含3％FBS，50μM2—巰基乙醇，1％L—谷氨酰胺、T3及細胞因子組合，每孔總體積100μl。置5％CO2，飽和濕度，37℃培養(yǎng)。每7天半量換液1次并補充新的細胞因子，濃度同前。 (6)流式細胞分析術分選或培養(yǎng)的1×106細胞標記前用含1％牛血清白蛋白(HAS)的PBS洗

9、滌1次，用熒光標記小鼠抗人單克隆抗體標記，置4℃條件下30 min，用含1％HAS的PBS洗滌1次，加0.4 m1含0.1％疊氮鈉的PBS，流式細胞儀檢測。分析軟件為Cellquest。 (7)CD34+細胞nucleostemi力基因表達的分析定量PCR反應用于nucleostemin基因分析。反應體系為25μl，包括：1μlcDNA模板和24μl反應混合液[其中含2.5mM MgCl2，20pmol引物，0.1μl Sybe

10、r greenⅠ(1：1000)]。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃預變性2min，(94℃30s，58℃30s，72℃30s)，40個循環(huán)。以GAPDH內參照，擴增長度為205 bp，GAPDH基因連于pMD—18T載體定量稀釋，作為標準曲線的模板。每個DNA樣品做2個平行管，重復3次實驗，反應結束后使用定量PCR儀的分析軟件對實驗結果進行分析，計算各樣本基因的原始拷貝數(shù)，單位為拷貝/μ lcDNA。Nucleostemin PCR擴增產(chǎn)物與

11、相應GAPDH的擴增產(chǎn)物原始拷貝數(shù)的比值能反映轉錄水平的差異。 此外，采取上述方法(PCR或RT—PCR)分析T3Rα1、T3Rα2、hT3Rβ1、Iμ、Cμ、IgLL、DQ52(D7-27)、DXP1(D3—9)、DQ52/DXP1等基因的表達、重組情況。 研究結果： (1)1.064g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離臍血細胞中，CFU—GM集落數(shù)為373±289/1×105MNC，BFU—E為121±

12、70/1×105MNC；在細胞因子刺激下，1.064g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離臍血MNC在體外擴增14天時CFU—GM的擴增倍數(shù)達52.2倍；1.064g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離的造血干/祖細胞可在8.5Gy致死劑量照射小鼠體內植入，輸注1.064g/ml Ficoll分離臍血MNC產(chǎn)生的脾結節(jié)數(shù)是輸注1.077g/ml Ficoll—泛影葡胺分離液分離臍血MNC的2.2倍。 (2)胎兒骨髓間質干

13、細胞表達CD29、CD44；免疫磁珠分選CD34+細胞的平均純度為97.4％；胎兒骨髓間質干細胞+CD34+細胞共培養(yǎng)28天，CD34+細胞仍占有核細胞的6.43％；CD34+細胞在胎兒骨髓間質干細胞、細胞因子作用下培養(yǎng)28天，有核細胞總數(shù)、CD34+細胞數(shù)分別被擴增1.65×105倍、788倍。 (3)T3誘導臍血造血干/祖細胞B細胞分化，在我們選用的實驗條件下，T3、IL—7與小鼠S—17基質細胞共培養(yǎng)是誘導CD34+CD1

14、9—造血干/祖細胞向B細胞分化的最佳條件，誘導的CD19+B部分細胞表達CD21，還表達CD10、CD20、CD24抗原，弱表達CD23抗原、HSL11、HSL96，不表達CD3、CD33、CD34、IgM抗原，B細胞向成熟方向發(fā)育；在小鼠S—17基質細胞支持下，單純T3誘導的CD19+B細胞大多數(shù)體積較小，CD19+B細胞幾乎不表達CD21，B細胞發(fā)育停留在較原始階段；34+CD19—CD38—造血干/祖細胞B細胞分化的擴增倍數(shù)明顯高

15、于34+CD19—造血干/祖細胞，持續(xù)擴增的時間也延長；新鮮臍血與凍存臍血CD34+CD19—造血干/祖細胞B細胞分化的純度、擴增倍數(shù)無明顯差異；小鼠S—17基質細胞高表達T3Rα1，傳代20代以上小鼠S—17基質細胞，失去支持臍血CD34+CD19—造血干/祖細胞B細胞分化的能力。 (4)純化的臍血CD34+CD19-造血干/祖細胞檢測到胚系DQ52基因，未發(fā)生DH-JH基因重排；誘導分化的B細胞優(yōu)先選擇DQ52-JH4、DQ

16、52-JH3、DQ52-JH5基因重排，未檢測到DQ52-JH、DQ52-JH2、DQ52-JH6基因重排；在整個B細胞分化發(fā)育過程中，我們檢測到持續(xù)的Iμ、Cμ、IgLL轉錄。 研究結論： (1)1.064g/ml Ficoll-泛影葡胺分離的造血干/祖細胞在體外具有較高的增殖、持續(xù)造血的能力及較強的體內造血重建潛能。 (2)胎兒骨髓間質干細胞可有效擴增臍血造血干/祖細胞。 (3)T3、IL7與小鼠S-