臍血CD133+造血干-祖細(xì)胞生物學(xué)特性的研究和抗CD133單克隆抗體的研制.pdf

1、本課題研究CDl33+造血干／祖細(xì)胞的生物學(xué)特性，探討其誘導(dǎo)分化和體外擴(kuò)增，并克隆CDl33基因全長及研制抗人CDl33單克隆抗體，為進(jìn)一步研究和利用CDl33打下基礎(chǔ)。 1．1臍血CDl33+細(xì)胞生物學(xué)特性的研究。 本研究從臍血中磁珠分選獲得CD34+CDl33+和CD34+CDl33-兩群細(xì)胞，繼而進(jìn)行體外細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，結(jié)果表明兩群細(xì)胞均得到顯著擴(kuò)增。相同擴(kuò)增體系中CD34+CDl33．細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)均高于CD34+C

2、Dl33+細(xì)胞。對CD34+CDl33+細(xì)胞擴(kuò)增后細(xì)胞表面抗原譜的動態(tài)變化進(jìn)行分析顯示，CD34+CDl33+細(xì)胞在擴(kuò)增過程中向CD34+CDl33．細(xì)胞演變，進(jìn)而最后分化為CD34-CDl33．細(xì)胞；細(xì)胞集落培養(yǎng)表明CD34+CDl33+細(xì)胞體外集落細(xì)胞形成多于CD34+CDl33-細(xì)胞，但沒有顯著性差別。但是CD34+CDl33+細(xì)胞以CFU-GM集落為主，而CD34+CDl33-細(xì)胞則BFU-E集落占多數(shù)：代表早期祖細(xì)胞的CFU-

3、GEMM和HPP-CFU的集落數(shù)量在CD34+CDl33+細(xì)胞組顯著高于CD34+CDl33．細(xì)胞組；長期培養(yǎng)啟動細(xì)胞測定CD34+CDl33+細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于CD34+CDl33．細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測CD34+CDl33+在擴(kuò)增狀態(tài)下細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)的動態(tài)變化也表明，擴(kuò)增前后粘附分子沒有顯著改變。 綜上所述，本研究顯示CD34+CDl33+細(xì)胞是比CD34+CDl33．細(xì)胞更原始的HSPC。對CD34+CDl33+細(xì)胞擴(kuò)增后細(xì)

4、胞表面抗原表達(dá)的動態(tài)變化進(jìn)行分析提示，CDl33分子可能是早于CD34的HSPC表面標(biāo)記。同時通過SCF+FL+TPO細(xì)胞因子組合，可以在體外有效對CD34+CDl33+細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，并且HSPC的擴(kuò)增對粘附分子的表達(dá)沒有明顯的影響，提示體外擴(kuò)增可能不會對HSPC的遷徙和歸巢造成影響。1．2臍血CD133+細(xì)胞重建SClD小鼠造血的實(shí)驗(yàn)研究 SCID小鼠造血重建模型可以進(jìn)行定量評估人HSPC的生物學(xué)特性，并確定HSPC植入SCI

5、D小鼠骨髓并重建造血的能力。本研究將CDl33+細(xì)胞和擴(kuò)增后的CDl33+細(xì)胞以及CDl33-細(xì)胞移植于SCID小鼠，并對造血功能重建進(jìn)行研究。 44只SCID小鼠，移植前所有小鼠均接受3．0Gy60C0照射，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，在輻照后4小時內(nèi)由尾靜脈注射移植細(xì)胞(CD34+CDl33+和CD34+CDl33-細(xì)胞)。繼而觀察實(shí)驗(yàn)小鼠存活狀況，3周后檢測小鼠骨髓人CD45+細(xì)胞和人alu基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：移植CD34+CDl33+

6、細(xì)胞小鼠存活率明顯高于移植CD34+CDl33-細(xì)胞小鼠；在移植新分離和培養(yǎng)擴(kuò)增CD34+CDl33+細(xì)胞的小鼠骨髓中都檢測到CD45+細(xì)胞和alu基因的存在。 本研究結(jié)果表明：CD34+CDl33+細(xì)胞具有比CD34+CDl33-細(xì)胞更原始的特性，擴(kuò)增后的CD34+CDl33+細(xì)胞同樣具有植入SCID小鼠骨髓造血重建的能力。 2.臍血CDl33+細(xì)胞誘--9分化樹突狀細(xì)胞的研究。 本實(shí)驗(yàn)就CDl33細(xì)胞和CD3

7、4細(xì)胞擴(kuò)增誘導(dǎo)DC的能力進(jìn)行比較，并對CD40分子激發(fā)對誘導(dǎo)DC作用進(jìn)行研究。 從臍血中分離獲得CD34+CDl33+和CD34+CDl33-細(xì)胞，新分離和擴(kuò)增后細(xì)胞加不同組合的細(xì)胞因子，根據(jù)細(xì)胞因子組合和加入細(xì)胞的不同分組：A組：CD34+CDl33+細(xì)胞+(GM-CSF+IL-41．5天+TNF．Q6—9天)：B組：CD34+CDl33．細(xì)胞+(GM-CSF+IL-41．5天+TNF．Q6-9天)；C組：擴(kuò)增7天后CDl33

8、+細(xì)胞+(GM-CSF+IL-4卜5天+TNF．-α6—9天)；D組：CD34+CDl33+細(xì)胞--I-CD40功能性單抗5C11。對DCs形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察和細(xì)胞表型分析以及擴(kuò)增效率比較，并進(jìn)行DC與T細(xì)胞體外混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：除B組外，其余各組細(xì)胞數(shù)量均得到有效擴(kuò)增。以C組擴(kuò)增效果最為明顯，A、D組則基本相同；對于細(xì)胞因子條件相同的A、B組來說，CD34+CDl33+細(xì)胞擴(kuò)增數(shù)量是CD34+CDl33．細(xì)胞的3．03倍

9、；各組誘導(dǎo)的細(xì)胞均表達(dá)CDlα、CD83、CD86和HLA-DR，但A組細(xì)胞表達(dá)上述分子陽性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于B組；C組細(xì)胞表達(dá)DC相關(guān)分子略少于A組(但無顯著性差異)，D組細(xì)胞基本與C組相當(dāng)，但D組細(xì)胞的CDlQ表達(dá)率顯著低于A、C兩組；MLR結(jié)果表明，各組均具有激發(fā)同種異體T細(xì)胞增殖的功能。A、C、D組間無顯著差異，但均高于B組，其中A組是B組的3．76倍。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，具有產(chǎn)生功能性DC的前體細(xì)胞主要存在于CDl33+細(xì)胞群，

10、同時通過擴(kuò)增和誘導(dǎo)兩步法可以獲得大量功能性DC，這表明可采用CDl33+細(xì)胞來研究DC的分化和發(fā)育的生物學(xué)特性；實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，CD40分子激發(fā)可有效地促進(jìn)CDl33+細(xì)胞源DC體外擴(kuò)增和分化，這為體外誘導(dǎo)DC提供了一條新的途徑。 3.人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞對CDl33+細(xì)胞體外擴(kuò)增的支持作用。 本研究采用胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(humanplactentaderivedmesenchymal-likestemcell

11、s，HPMSC)觀察其對CDl33+HSPC的擴(kuò)增作用。由胎盤分離培養(yǎng)得到的間充質(zhì)樣細(xì)胞具有BMSCs相似的形態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)志：細(xì)胞形態(tài)呈類似成纖維細(xì)胞，免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測顯示該群細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44和CDl05(SH2)分子，但不表達(dá)CDllb、CD34、CD45、CDl9、CDl06、HLA-DR、v'~VF、CDll7、FASL,·CD40、CD40L等。對HPMSCs分泌細(xì)胞因子進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，HPMSC分泌SCF

12、、IL-6和TNF-tt以及分泌大量的SDF．1α，但不產(chǎn)生IL-3和GM-CSF。CDl33+細(xì)胞與HPMSCs共培養(yǎng)后，HPMSCs能有效擴(kuò)增CDl33+細(xì)胞；并且不同擴(kuò)增時間細(xì)胞表面粘附分子沒有顯著性變化。 結(jié)果表明：胎盤來源的HPMSC可在體外有效擴(kuò)增HSPC。一方面大大提高了HSPC擴(kuò)增的數(shù)量和質(zhì)量，另一方面在HSPC歸巢和抑制免疫排斥方面的作用將大大提高移植的成功率。這也表明移植時同時采用同一個體的胎盤源MSC和臍血

13、CDl33+細(xì)胞完全有可行性，這為臍血干細(xì)胞移植開拓了新的途徑，具有重要的使用價值。 4．100133—2分子的克隆及其轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建 研究表明CDl33可能是較CD34更為有價值的HSPC表面標(biāo)志，隨著研究的進(jìn)展，CDl33將在多個方面顯示更重要的價值。本研究旨在克隆人CDl33-2全長基因，構(gòu)建其轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，為制備抗人CDl33-2單克隆抗體和研究CDl33-2的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。 根據(jù)CDl33-2基因

14、(GeneBank：AF507034)序列，以骨髓cDNA文庫為模板，在分段克隆的基礎(chǔ)上采用人工延伸等手段獲得人CDl33-2基因，裝入PMDl8-T-Vector載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a大腸桿菌。重組質(zhì)粒T-CDl33-2經(jīng)測序正確。重組質(zhì)粒T-CDl33-2經(jīng)PCR擴(kuò)增CDl33-2全長基因并引入PstI和BamHI酶切位點(diǎn)，裝入逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體pGEZ-term，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5ct大腸桿菌，重組質(zhì)粒pGEZ-CDl33-2經(jīng)測序正

15、確。 pGEZ-CDl33-2、輔助病毒載體pHIT456和pHIT60混合后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞-293T細(xì)胞，獲得具有感染能力的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。將含有完整CDl33-2重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的293T細(xì)胞上清混合WEHI細(xì)胞上清，感染L929細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，并用不同濃度的Zeocine加壓篩選獲得抗性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀分析，獲得穩(wěn)定表達(dá)CDl33-2分子的L-CDl33-2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。 本研究

16、利用高質(zhì)量的cDNA基因文庫提供的高質(zhì)量模板，采用分段克隆的方法，成功克隆CDl33-2全長基因并構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，為制備抗人CDl33-2單克隆抗體和進(jìn)一步研究CDl33的生物學(xué)功能奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。 4．2CDl33-2單克隆抗體的研制 以L929-CDl33細(xì)胞作為免疫原，免疫Balb／c小鼠。采用B淋巴瘤雜交瘤技術(shù)，將免疫Balb／c小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0進(jìn)行融合，經(jīng)HAT篩選，以L929-CDl33

17、篩選抗原，經(jīng)多次亞克隆化及反復(fù)篩選，在融合的10塊96孔板中，最終得到1株持續(xù)分泌抗人CDl33-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(1F8)。將雜交瘤細(xì)胞注入降植烷(Pristane)預(yù)致敏的Balb／c小鼠，誘生腹水。快速定性試紙條分析法結(jié)果顯示：1F8Ig類別為IgGl。 以WERI-Rb．1為競爭靶細(xì)胞，采用競爭抑制實(shí)驗(yàn)分析1F8識別的抗原位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1F8與商品化單抗293C3識別完全不同的位點(diǎn)。 選擇多個細(xì)胞株