鼠抗人CXCR4單克隆抗體的研制及其對腫瘤細胞和T細胞生物學作用的研究.pdf

1、CXCR4/SDF-1α是目前最受關注的一對趨化因子配體和受體，相關研究揭示它們參與了細胞的生長、發(fā)育、分化和增殖等多種生理功能，并在多種病理過程中發(fā)揮重要作用。CXCR4/SDF—1α為人們廣為熟知的生物學功能是在炎癥反應中趨化各種炎癥細胞到損傷部位，參與了炎癥細胞的滾動、黏附和跨內皮遷移等一系列過程。許多研究表明，腫瘤轉移和炎癥細胞浸潤有著相似的形成過程，如均涉及到細胞滾動、黏附和跨內皮遷移等。也有研究報道，腫瘤細胞可以限定性表達某

2、些趨化因子或趨化因子受體，并且存在趨化因子信號途徑異常的狀態(tài)，提示趨化因子或其受體可能通過與炎癥細胞浸潤相似的機制參與了腫瘤的轉移。目前CXCR4/SDF—1α參與多種腫瘤如乳腺癌、肺癌、前列腺癌的轉移和擴散已見報道。
　　 近來的還研究發(fā)現(xiàn)，在有效的免疫應答中，SDF—1α不僅能趨化T細胞到次級淋巴器官，而且對T細胞的活化還具有協(xié)同刺激作用。Nanki研究發(fā)現(xiàn)，在風濕性關節(jié)炎的關節(jié)腔內有大量的記憶性CD4+T的集聚，其細胞表面

3、CXCR4的表達水平大大提高，關節(jié)腔內SDF—1α表達水平也大大提高，推測CXCR4/SDF—1α的相互作用可能既可以聚集T細胞，而且為可T細胞活化提供一個潛在的協(xié)同刺激信號。
　　 盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CXCR4/SDF—1α有多種不同的生物學功能，并且推測它在行使不同的功能時依靠不同的的信號途徑。但是這些功能的的作用機制，信號傳導差異以及影響因素還需要進一步深入研究。
　　 本研究旨在通過CXCR4基因轉染細胞株作為免疫

4、原免疫小鼠研制獲得鼠抗人CXCR4單克隆抗體，并以抗人CXCR4單抗為材料研究揭示人CXCR4/SDF—1α在膠質瘤細胞上表達的生物學意義和對T細胞的協(xié)同刺激作用。
　　 一、鼠抗人CXCR4單克隆抗體的研制及生物學特性的鑒定
　　 [目的]研制鼠抗人CXCR4單克隆抗體，為探討人CXCR4/SDF—1α的生物學功能及其機制提供必備的物質手段。
　　 [方法]利用高表達人CXCR4分子的基因轉染細胞株L929/C

5、XCR4為免疫原，常規(guī)免疫BALB/C小鼠。采用B淋巴細胞雜交瘤融合技術研制鼠抗人CXCR4單克隆抗體，并以該基因轉染細胞L929/CXCR4作為陽性篩選細胞，以轉空質粒的對照細胞L929/Mock作為陰性篩選細胞。經(jīng)間接免疫熒光標記和流式細胞術分析、反復篩選和多次克隆化培養(yǎng)，獲得特異分泌鼠抗人CXCR4分子單克隆抗體的雜交瘤細胞株；采用細胞核染色體計數(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、競爭結合抑制以及Westernblot等試驗，對獲得的雜交

6、瘤細胞株及單克隆抗體進行生物學特性的鑒定；用間接免疫熒光法初步分析單抗對免疫細胞表達CXCR4的識別作用。
　　 [結果]成功獲得2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人CXCR4單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為6H7和7D4。核型分析顯示，雜交瘤細胞株的染色體數(shù)目在100條以上，超過小鼠B細胞和SP2/0細胞的染色體數(shù)，表明為融合體；經(jīng)過快速定性試紙分析顯示，2株單抗輕鏈均為κ鏈，6H7重鏈為IgG1亞類，而7D7重鏈為IgG2a；Wes

7、ternblot分析結果顯示，單抗7D4能與CXCR4分子特異性結合，形成陽性條帶；單抗識別的抗原表位分析結果表明，單抗6H7和7D4與商品化的鼠抗人CXCR4單抗(克隆號12G5)識別不同的抗原表位。流式細胞儀檢測結果表明，單抗6H7和7D4能檢測到PBMCs亞群上CXCR4分子的表達。
　　 [結論]成功獲得兩株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CXCR4單抗的雜交瘤細胞株，兩株單抗識別的抗原位點不同，與商品化單抗12G5識別的抗原位點也

8、不同，是兩株新型的抗人CXCR4單克隆抗體。這兩株抗人CXCR4單抗的研制成功為探討CXCR4表達特性、CXCR4/SDF—1α多種生物學功能及其機制提供必備的物質手段。
　　 二、CXCR4/SDF—1α信號促進膠質瘤細胞遷移和增殖及其單抗阻斷作用的研究
　　 [目的]利用研制的CXCR4單抗，初步分析了CXCR4在多種腫瘤細胞株和膠質瘤組織上的表達，以及探討了CXCR4/SDF—1α介導信號在單抗阻斷和非阻斷情況下對

9、膠質瘤細胞株U251體外生物物學行為的影響。
　　 [方法]采用間接免疫熒光標記法分析腫瘤細胞株表面CXCR4分子的表達，用免疫組織化學法檢測膠質瘤組織中CXCR4的表達。MTT法研究了SDF—1α刺激的膠質瘤細胞株U251體外增殖及單抗7D4的阻斷作用。用趨化小室分析了CXCR4/SDF—1α信號對膠質瘤細胞U251的體外遷移作用及單抗的阻斷作用。
　　 [結果]流式細胞儀分析結果，顯示大多數(shù)腫瘤細胞株上都表達CXCR

10、4分子，尤其是造血系統(tǒng)來源的腫瘤細胞株CXCR4表達較高，而在上皮源性的腫瘤細胞株M231、MCF—7和95D上表達相對偏低。免疫組化的結果表明，膠質瘤組織上檢測到CXCR4的表達。增殖與抗體阻斷實驗結果表明，SDF—1α能夠刺激U251體外增殖，并且有濃度依賴性；CXCR4特異性的單抗7D4能阻斷SDF—1α的這一激發(fā)作用。遷移實驗結果顯示單抗7D4也能阻斷SDF—1α誘導的U251細胞的體外遷移作用，表明研制的抗人CXCR4單抗7D

11、4具有阻斷作用。
　　 [結論]本研究分析并證實了CXCR4在腫瘤細胞株表面的廣泛表達和在膠質瘤組織上表達；CXCR4/SDF—1α信號能夠作用于膠質瘤細胞株的體外生長和轉移，推測該信號與膠質瘤侵襲性生長有關。
　　 三、CXCR4/SDF—1α信號對T細胞協(xié)同刺激及其單抗阻斷作用的研究
　　 [目的]利用所獲得的抗人CXCR4單克隆抗體7D4和重組人SDF—1α，探討CXCR4/SDF—1α相互作用對T細胞協(xié)同

12、刺激作用。
　　 [方法]采用熒光單標或雙標記法通過流式細胞術分析DC誘導成熟過程中細胞表面及PHA活化的CD4+、CD8+T淋巴細胞上的CXCR4的表達；用激發(fā)型抗人CD3單抗包板，重組人SDF—1α聯(lián)合或不聯(lián)合抗人CD28單抗處理，通過流式細胞術、MTT法和ELISA法分別測定了SDF—1α對T淋巴細胞活化、增殖及細胞因子分泌的作用；在此基礎上，用激發(fā)型抗人CD3單抗包板，選用特定的SDF—1α濃度和CD28單抗聯(lián)合處理，通

13、過流式細胞術、MTT法和ELISA法分別測定單抗7D4對T淋巴細胞活化、增殖及細胞因子分泌的影響；
　　 [結果]PHA活化條件下，CD4+T細胞上CXCR4呈上調性表達，隨后表達有所下降。而在CD8+T細胞上沒有明顯的變化；CXCR4分子在單核細胞誘導至mDC過程中，呈現(xiàn)逐步上調性表達。SDF—1α單獨作用時，并不能明顯促進T細胞的體外增殖、活化和上調細胞因子的分泌，而與CD28信號協(xié)同作用時，SDF—1α則能促進T細胞的增殖

14、和細胞因子的分泌，并且有一定的劑量依賴性。但是，對T細胞上CD25和CD69的表達無顯著影響。單抗7D4可阻斷SDF—1α對T細胞的協(xié)同刺激作用，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。而且單抗7D4能不同程度地下調CD4+T細胞上CD25和CD69的表達，但對CD8+T上的CD25和CD69影響并不明顯。
　　 [結論]以研制獲得的抗人CXCR4單抗7D4和重組人SDF—1α為手段，揭示了CXCR4在免疫細胞上的調節(jié)性表達。同時，CXCR4/

15、SDF—1α信號在與CD28信號共同作用時，對T細胞的活化具有協(xié)同刺激作用，單抗7D4能抑制SDF—1α的協(xié)同刺激作用。
　　 綜上所述，本研究成功獲得了兩株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CXCR4單抗的雜交瘤細胞株，進一步對單抗的生物學特性進行了鑒定。在此基礎上分析了PBMCs亞群上CXCR4的表達譜。通過對腫瘤表面CXCR4表達的檢測和在膠質瘤細胞株上的功能分析，證實了CXCR4是腫瘤組織中廣泛表達的分子，并且對膠質瘤細胞的增殖、侵襲