抗CP4-EPSPS單克隆抗體的制備和生物學(xué)特性的研究.pdf

1、目的：隨著各種各樣轉(zhuǎn)基因食品通過貿(mào)易大量進入國際市場，轉(zhuǎn)基因食品的安全性受到人們?nèi)找骊P(guān)注，世界各國對轉(zhuǎn)基因食品的安全性存在著較大的爭議，歐盟、日本等地區(qū)已經(jīng)制定了相關(guān)法規(guī)對轉(zhuǎn)基因食品進行了嚴(yán)格的管理。以孟山都(Monsato)公司的專利基因-CP4EPSPS基因使用最為廣泛，目前已廣泛用于玉米、大豆、棉花等農(nóng)作物。CP4 EPSPS基因來源于土壤農(nóng)桿菌株系(Agrobacteriumsp)CP4株系，CP4 EPSPS基因編碼CP4 E

2、PSP合成酶，該酶對除草劑草甘膦有高抗性。本研究擬通過制備抗CP4-EPSPS蛋白的單克隆抗體，對抗體生物學(xué)特性進行鑒定，為國產(chǎn)EPSPS膠體金試紙條的研究創(chuàng)造條件，為建立快速特異檢測轉(zhuǎn)基因植物(GMO)的實驗方法提供的工具。 方法：誘導(dǎo)表達含轉(zhuǎn)基因大豆CP4-EPSPS基因的原核表達重組載體pQE30/CP4-EPSPS、pET32a(+)/CP4-EPSPS，并且采用了Ni<'2+>-NTA樹脂親和層析純化CP4-EPSPS

3、蛋白，以SDS-PAGE進行初步鑒定，并以膠體金試紙條鑒定其免疫活性。以重組蛋白CP4-EPSPS免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備抗CP4-EPSPS的McAb，采用間接ELISA方法和Western blot進行McAb特異性鑒定；同時采用間接ELISA方法鑒定McAb的Ig亞類、效價及相對親和力，并進行McAb抗原結(jié)合表位分析；并對雜交瘤細(xì)胞的染色體進行分析。 結(jié)果：重組蛋白CP4-EPSPS主要以包涵體表達，上清表

4、達量極低，但膠體金試紙條檢測發(fā)現(xiàn)上清中CP4-EPSPS蛋白抗原活性強，復(fù)性包涵體中CP4-EPSPS蛋白的抗原性遠低于上清中CP4-EPSPS蛋白的抗原性。采用擴大培養(yǎng)量、縮小超聲破碎重懸體積的方法，從上清中純化CP4-EPSPS蛋白獲得成功。通過雜交瘤技術(shù)成功獲得兩株可分泌特異性McAb的雜交瘤細(xì)胞Ⅲ5A3，Ⅲ13A2。其抗體亞類均為IgG1；腹水效價分別為1：10<'6>和1：10<'8>；相對親和Ⅲ5A3在10<'5>以上，Ⅲ1