抗RON受體酪氨酸激酶單克隆抗體的制備和生物學(xué)特性研究.pdf

1、酪氨酸激酶受體(RTK)是一類具有特殊結(jié)構(gòu)的穿膜蛋白.目前,己經(jīng)有20種RTK家族被發(fā)現(xiàn).RTK的異常激活能在很多病理情況下被檢測(cè)到,比如EGFR家族的高表達(dá)和異常激活是乳腺癌和肺癌病程進(jìn)展的重要標(biāo)志.因此,RTK可被作為一個(gè)腫瘤治療干預(yù)的靶向位點(diǎn).像目前應(yīng)用于臨床的赫賽汀就是一種EGFR2(Her2)的單克隆抗體,它已經(jīng)在乳腺癌和肺癌的治療中體現(xiàn)出了非常顯著的效果. RON受體酪氨酸激酶(recepteur d'origine nan

2、tais,RON)屬于MET原癌基因家族.自從于1993年被發(fā)現(xiàn)后,對(duì)其生物化學(xué)以及生物學(xué)特性的研究已經(jīng)耳義得了重要的進(jìn)展.研究發(fā)現(xiàn)RON在胚胎發(fā)育、腫瘤惡性表型形成以及炎癥機(jī)制中起著重要的作用. 本實(shí)驗(yàn)通過以轉(zhuǎn)染RON的NIH 3T3細(xì)胞為抗原制備抗RON的單克隆抗體,鑒定該抗體的特性,研究它對(duì)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞系在5-氟尿嘧啶(5-Fu)化療耐藥方面的影響,并試圖探討其中的相關(guān)機(jī)制. [實(shí)驗(yàn)方法]: 1.用重組

3、質(zhì)粒pDR2-wt-RON、pcDNA3.1-RON△160分別轉(zhuǎn)染小鼠胚成纖維細(xì)胞NIH 3T3和結(jié)腸癌細(xì)胞RKO,克隆化培養(yǎng)出wt-RON NIH 3T3、wt-RONRKO、RON△160 RKO細(xì)胞株. 2.以wt-RON NIH 3T3為細(xì)胞抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,然后用HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞. 3.用改良的間接免疫法篩選出具有能分泌抗、wt-RON NIH 3T3

4、而小抗NIH 3T3的雜交瘤細(xì)胞株. 4.有限稀釋法單克隆化培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞株,并再次用改良間接免疫熒光法篩選細(xì)胞株. 5.用篩選出的產(chǎn)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株注射到小鼠腹腔以制備腹水瘤,通過收集腹水取得單克隆抗體粗品,并以正辛酸-硫酸氨法提純. 6.用制備的5種抗體以改良的間接免疫熒光法分別檢測(cè)NIH 3T3、wt-RON NIH3T3、RKO、wt-RON RKO、RON△160 RKO、293、HT-29、DL

5、D1、Lovo、MCF7等10個(gè)細(xì)胞株RON的表達(dá). 7.用MTT比色法檢測(cè)wt-RON RKO、RON△160 RKO細(xì)胞株對(duì)化療藥物5-Fu的耐藥性影響. 8.用MTT比色法檢測(cè)單抗對(duì)wt-RON、RON△160 RKO細(xì)胞株的生長以及5-Fu耐藥方面的作用. [結(jié)果]: 1.制備出18株產(chǎn)抗體雜交瘤細(xì)胞株,其中15株能夠穩(wěn)定分泌抗體.2.5株抗體對(duì)10個(gè)細(xì)胞系的特異性結(jié)合情況各有不同,但基本能夠反應(yīng)

6、其對(duì)表達(dá)RON、和RON變異體細(xì)胞的特異性結(jié)合能力.3.相比RKO、wt-RON RKO細(xì)胞,RON△160 RKO細(xì)胞對(duì)5-Fu具有更強(qiáng)的化療耐藥性.MSP在對(duì)5-Fu的耐藥性形成方面未表現(xiàn)出明顯作用.4.5株抗體對(duì)wt-RON RKO、RON△160 RKO細(xì)胞株無明顯的中和活性,其中4株反而可增加細(xì)胞對(duì)5-Fu的耐藥性.[結(jié)論]1.制備出具能分泌RON特異性單克隆抗體的1 5個(gè)細(xì)胞株. 2.RON變異體的表達(dá)可產(chǎn)生抗凋亡作