一個(gè)新的酪氨酸激酶受體RON的剪接變異體的生物學(xué)特征及其功能的初步研究.pdf

1、酪氨酸激酶受體RON的變異體在結(jié)直腸腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,到目前為止已有6個(gè)和腫瘤相關(guān)的RON的變異體被發(fā)現(xiàn),其中4個(gè)能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,已經(jīng)有近6年沒(méi)有具有促腫瘤轉(zhuǎn)移功能的RON變異體被發(fā)現(xiàn)。在我們最近的研究中我們?cè)诮Y(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的變異體,由于RT-PCR及測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺失了外顯子2和3,共計(jì)318個(gè)堿基,也就是缺少了106個(gè)氨基酸,因此我們將其命名為RON106,其生物學(xué)特征及功能尚不明確。
　　 目的:

2、探討新變異體的分子量大小、表達(dá)部位等生物學(xué)特征,以及對(duì)細(xì)胞移動(dòng)／浸潤(rùn)能力的初步研究。
　　 方法:首先用RT-PCR方法檢測(cè)在常見(jiàn)的結(jié)直腸癌以及胃癌細(xì)胞株中外顯子2、3的缺失情況；用免疫沉淀以及Western Blot免疫印跡的方法測(cè)定在HCT-116細(xì)胞中該變異體的分子量大?。灰訮CR克隆的方法構(gòu)建含RON106的質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染至上皮細(xì)胞HEK-293細(xì)胞中建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系；以免疫沉淀和Western Blot證實(shí)RON10

3、6受體在HEK-293細(xì)胞中表達(dá)的分子量大小,并判斷其α、β鏈及pro-RON106的存在情況；采用細(xì)胞表面標(biāo)記的方法判斷在缺失外顯子2和3后RON106是否仍在細(xì)胞膜上表達(dá)；以免疫沉淀以及Western Blot免疫印跡的方法檢測(cè)RON106的自磷酸化情況以及在配體MSP刺激后的磷酸化情況；以細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)以及劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定293RON106細(xì)胞移動(dòng)能力的改變。
　　 結(jié)果:在多個(gè)結(jié)直腸癌以及胃癌的細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)存在RON的外顯子2

4、和3的缺失；在HCT-116中發(fā)現(xiàn)RON106蛋白的表達(dá),免疫沉淀以及Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其分子量約160Kd；我們通過(guò)PCR克隆的方法建立pcDNA3.1(RON106)的質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系-293RON106；通過(guò)免疫沉淀以及Western Blot檢測(cè)同樣證實(shí)其分子量約160Kd,但不論是否有MSP的刺激,RON106均不產(chǎn)生酪氨酸的磷酸化；通過(guò)檢測(cè)其下游通路發(fā)現(xiàn),RON106能自主激活

5、AKT但不能激活p-erk1／2,AKT在293RON106細(xì)胞中的激活與MSP的刺激無(wú)關(guān),可能由于與PI3-K的p85亞單位直接結(jié)合從而引起下游通路的激活；同時(shí)該蛋白僅有pro-ΔRON存在,在自然狀態(tài)下其α、β鏈不發(fā)生分離,缺乏成熟的RON106α、β鏈,而且通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)記發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)僅在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),不在細(xì)胞膜上表達(dá),但在還原劑2-巰基乙醇的作用下可部分形成成熟的β鏈和α鏈；通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)以及劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對(duì)于空載對(duì)照細(xì)胞以及2

6、93wtRON細(xì)胞在沒(méi)有MSP刺激的情況下,293RON106細(xì)胞的移動(dòng)能力增強(qiáng),但RON的配體MSP并不能增強(qiáng)其移動(dòng)能力。而且PI3-K的抑制劑LY294002能抑制RON106引起的細(xì)胞移動(dòng),但MAPK的抑制劑PD98059不能抑制其移動(dòng)。
　　 結(jié)論:我們新發(fā)現(xiàn)的變異體RON106其分子量大小約160Kd,在多個(gè)結(jié)直腸癌及胃癌細(xì)胞系中可發(fā)現(xiàn)RON106的存在.在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系293RON106中,RON106在細(xì)胞漿內(nèi)表