c-Ab1非受體酪氨酸激酶介導(dǎo)的FoxM1磷酸化及其功能研究.pdf

1、非受體酪氨酸激酶c-Abl廣泛存在于哺乳動(dòng)物各種組織細(xì)胞中，通過(guò)介導(dǎo)底物蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化修飾，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生形成等生命過(guò)程的調(diào)控。在正常生理?xiàng)l件下，c-Abl的激酶活性受到嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控，被多種細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激或DNA損傷應(yīng)激激活后的c-Abl激酶活性大大提高，通過(guò)定位于不同的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)發(fā)揮不同的生理功能。c-Abl具有重要的功能結(jié)構(gòu)域，其SH3結(jié)構(gòu)域能識(shí)別富含脯氨酸的蛋白基序，與底

2、物結(jié)合密切相關(guān);其SH2結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別磷酸化的酪氨酸殘基基序;NLS及NES結(jié)構(gòu)域引導(dǎo)c-Abl在細(xì)胞核質(zhì)間穿梭，發(fā)揮不同的生理功能。
　　轉(zhuǎn)錄因子FoxM1屬于FOX家族，它在DNA結(jié)合區(qū)域上呈翼狀螺旋結(jié)構(gòu)，在不同的細(xì)胞周期時(shí)相中，其表達(dá)水平及轉(zhuǎn)錄激活活性不同，能夠調(diào)控細(xì)胞周期特異性基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控及DNA損傷修復(fù)等過(guò)程。c-Abl與FoxM1均密切參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理活動(dòng)

3、，兩者之間是否存在聯(lián)系值得探討。
　　本研究將就二者間的相互作用、磷酸化修飾、穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、泛素化修飾降解及其對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響等方面進(jìn)行深入研究。
　　本研究通過(guò)免疫共沉淀及免疫印跡證實(shí)，c-Abl及FoxM1在人乳腺癌細(xì)胞MCF-7內(nèi)能形成免疫復(fù)合物，異源表達(dá)的Flag-FoxM1及Myc-c-Abl也存在相互作用，且其相互作用不依賴于c-Abl的激酶活性。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)c-Abl通過(guò)SH2、SH3結(jié)構(gòu)域與FoxM1

4、相結(jié)合，且SH2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力更強(qiáng)。由于SH2結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別磷酸化的酪氨酸殘基序列，提示FoxM1上有酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。為此，我們對(duì)其酪氨酸磷酸化修飾作進(jìn)一步研究。
　　通過(guò)免疫共沉淀及抗酪氨酸磷酸化抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1能被c-Abl酪氨酸磷酸化。細(xì)胞周期同步化后發(fā)現(xiàn)FoxM1酪氨酸磷酸化修飾主要發(fā)生于細(xì)胞有絲分裂期，提示c-Abl介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化修飾可能參與了FoxM1在細(xì)胞有絲分裂期的功能調(diào)控。隨后，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)Fox

5、M1存在5個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，分別為Y129、Y272、Y317、Y377和Y590。通過(guò)構(gòu)建磷酸化位點(diǎn)突變體，發(fā)現(xiàn)與野生型FoxM1相比，各突變體的磷酸化水平均有不同程度減弱，其中Y272F與Y590F突變體的磷酸化水平減弱最明顯，僅為野生型的10％，提示這兩個(gè)位點(diǎn)是c-Abl介導(dǎo)的主要磷酸化修飾位點(diǎn)。我們接下來(lái)的研究工作也將主要圍繞這兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)展開。
　　研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在293FT細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Myc-c-Abl能夠顯著提

6、高FoxM1在細(xì)胞中的表達(dá)水平;并且在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，當(dāng)c-Abl及其相關(guān)基因Arg雙敲除后，F(xiàn)oxM1的半衰期縮短，提示c-Abl對(duì)維持FoxM1的穩(wěn)定性有重要作用。隨后我們發(fā)現(xiàn)，c-Abl能夠顯著抑制FoxM1的泛素化修飾，并且這種抑制作用依賴c-Abl激酶活性。進(jìn)一步對(duì)FoxM1磷酸化突變體的泛素化修飾進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，與野生型FoxM1相比，Y272F與Y590F磷酸化突變體的泛素化修飾明顯增強(qiáng);且Y272/590F雙突變體

7、的泛素化水平增強(qiáng)尤為顯著。上述結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，c-Abl介導(dǎo)的FoxM1酪氨酸磷酸化可抑制其泛素化修飾。
　　隨后，我們對(duì)FoxM1磷酸化位點(diǎn)突變導(dǎo)致泛素化水平增加的分子機(jī)制進(jìn)行更深入的探討，發(fā)現(xiàn)FoxM1酪氨酸磷酸化位點(diǎn)突變后，與APC/C E3泛素連接酶組份Cdh1的結(jié)合作用顯著增強(qiáng)。Cdh1能夠識(shí)別并招募FoxM1通過(guò)泛素—蛋白酶體途徑降解。至此，我們提出c-Abl促進(jìn)FoxM1穩(wěn)定性的機(jī)制，即c-Abl通過(guò)酪氨酸磷酸化修飾

8、，抑制FoxM1與E3泛素連接酶招募分子Cdh1的結(jié)合，并進(jìn)一步抑制FoxM1經(jīng)泛素—蛋白酶體途徑降解，提高FoxM1在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。
　　c-Abl介導(dǎo)的FoxM1酪氨酸磷酸化修飾對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程同樣具有調(diào)控作用。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，表達(dá)Flag-FoxM1Y590F突變體細(xì)胞的有絲分裂起進(jìn)程顯著縮短，且其細(xì)胞周期依賴性蛋白Cyclin B1在有絲分裂期的降解顯著加快。這一結(jié)果提示，c-Abl對(duì)FoxM1的磷酸化修

9、飾可顯著影響FoxM1對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用，具體的機(jī)制有待深入研究。
　　綜合以上結(jié)果，本研究主要進(jìn)展如下:
　　1）c-Abl與FoxM1能夠在細(xì)胞內(nèi)/外相互作用形成復(fù)合物;
　　2）c-Abl可介導(dǎo)FoxM1發(fā)生酪氨酸磷酸化修飾，且修飾主要發(fā)生在有絲分裂期;
　　3）質(zhì)譜鑒定并通過(guò)點(diǎn)突變證實(shí)FoxM1的Y129、Y272（通過(guò)磷酸化數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn)）、Y317、Y377及Y590位點(diǎn)可被酪氨酸磷酸化修飾，Y27

10、2和Y590為主要磷酸化位點(diǎn);
　　4）c-Abl介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化能夠提高FoxM1在細(xì)胞中表達(dá)水平，并提高其穩(wěn)定性;
　　5）c-Abl介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化能夠顯著抑制FoxM1的泛素化修飾;6）c-Abl介導(dǎo)的酪氨酸磷酸化通過(guò)抑制APC/C E3泛素連接酶組份Cdh1對(duì)FoxM1的識(shí)別招募，進(jìn)而抑制FoxM1的泛素化修飾;7）表達(dá)FoxM1Y590F磷酸化突變體的細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程顯著加快，提示FoxM1Y590F較野生型

11、FoxM1可能具有更高的轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　本研究首次證實(shí)非受體酪氨酸激酶c-Abl與FoxM1之間存在相互作用，并首次證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子FoxM1能夠被酪氨酸磷酸化修飾。c-Abl介導(dǎo)的FoxM1酪氨酸磷酸化具有雙向調(diào)節(jié)作用:一方面可抑制其與Cdh1的結(jié)合，進(jìn)而抑制FoxM1經(jīng)泛素—蛋白酶體途徑降解，提高FoxM1在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性;另一方面，也會(huì)在一定程度上抑制，F(xiàn)oxM1的轉(zhuǎn)錄激活活性。這兩方面的調(diào)控作用相互制約，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程