Trihydrophobin1的酪氨酸磷酸化調控及核受體FXR在酒精性脂肪肝中的作用研究.pdf

1、基因在表達翻譯后形成蛋白質，其氨基酸序列不再是其功能的唯一決定因素，翻譯后修飾在蛋白質結構功能成熟過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。在應對外界環(huán)境因素作用下，細胞內大量的蛋白質的功能實現(xiàn)是通過動態(tài)的翻譯后修飾來完成的。翻譯后修飾的作用賦予蛋白質更加豐富信息，現(xiàn)已知的翻譯后修飾有上百種，研究蛋白質翻譯后修飾對于闡明蛋白質在維持機體正常生理過程以及預防治療相關疾病具有重要意義。本論文中我們研究了Trihydrophobin1的酪氨酸磷酸化在MAPK

2、/ERK信號轉導中的效應以及核受體FXR的乙?；诰凭灾靖沃械淖饔?，初步闡明翻譯后修飾在細胞正常生理過程中的復雜調控機制以及進行疾病模型中的轉化研究。
　　第一部分 Trihydrophobin1的酪氨酸磷酸化調控研究。c-Src是一種非受體型酪氨酸激酶，在細胞增殖、存活、黏附、形態(tài)形成以及細胞遷移中都發(fā)揮關鍵作用。在細胞內c-Src持續(xù)活化促進細胞增殖和遷移。原癌基因c-Src的同源蛋白，v-Src，它為持續(xù)活化的激酶，并能

3、導致腫瘤形成。已經在人類多種癌癥中發(fā)現(xiàn)的c-Src高表達及激酶活性增高。Trihydrophobin1(TH1)基因從果蠅到人類的種屬間都是高度保守，在心肌、骨骼肌、腎臟、腎上腺以及甲狀腺等多種組織中廣泛表達。TH1蛋白能夠特異性的與MAPK/ERK信號通路的分子A-Raf相互作用，并且抑制A-Raf蛋白的激酶活性，此外，TH1還能與和PAK1相互作用對其激酶活性負調節(jié)，并且能夠抑制MAPK/ERK信號傳導及細胞遷移過程。TH1在乳腺癌

4、中低表達，其表達水平與乳腺癌惡性程度成負相關，推斷TH1可能是一個抑癌基因。
　　盡管我們對TH1功能的理解已經發(fā)展，但對TH1本身的功能調節(jié)還知之甚少。本課題中，我們通過免疫共沉淀，GST-pull down的方法鑒定了c-Src與TH1在細胞內和體外均存在相互作用，這種相互作用依賴于c-Src的活化后結構開放狀態(tài)。并且內源性的c-Src與TH1也存在相互作用。通過激光共聚焦技術，我們觀察到細胞內源性的c-Src與TH1在胞質內

5、存在共定位。在細胞內及體外實驗中，我們又發(fā)現(xiàn)c-Src能夠磷酸化TH1，其酪氨酸磷酸化依賴于c-Src的激酶活性，采用c-Src的特異性抑制劑PP2幾乎完全阻斷了TH1酪氨酸磷酸化。通過缺失突變、點突變和生物信息學方法，我們鑒定了磷酸化位點位于TH1的第6位酪氨酸。磷酸化的TH1與A-Raf及PAK1的相互作用能力降低，進一步的實驗中我們發(fā)現(xiàn)TH1第6位酪氨酸的磷酸化減弱其對MAPK/ERK信號轉導的抑制作用，對c-Src驅動的細胞遷移

6、的抑制作用也減弱了。TH1非磷酸化的突變體TH1(TH1-Y6F)依然能夠抑制MAPK/ERK信號轉導及c-Src驅動的細胞遷移，TH1模擬持續(xù)磷酸化的突變體則幾乎喪失了對MAPK/ERK信號轉導的抑制作用以及對細胞遷移的抑制效果。此外，我們發(fā)現(xiàn)EGF及雌激素刺激情況下能夠誘導細胞內源性的TH1酪氨酸磷酸化。綜上所述，我們推斷存在c-Src通過酪氨酸磷酸化TH1進而調控Ras/Raf/MEK/ERK信號轉導及細胞遷移過程機制。
　

7、　第二部分核受體FXR及其乙?；谛∈缶凭灾靖沃械淖饔眉跋嚓P機制研究。核受體FXR對維持肝臟正常生理功能至關重要，在糖代謝、脂代謝、膽汁酸代謝的調控起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XR缺失小鼠血糖、血脂、膽固醇異常升高。活化FXR能夠在膽汁淤積性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纖維化等慢性肝臟疾病中保護肝臟免受損傷。
　　我們采用Lieber-DeCarli酒精液體飼料喂食小鼠構建酒精性脂肪肝模型，同時采用FXR缺失小鼠以及灌胃給予小鼠FX

8、R激動劑WAY362450處理，研究FXR在小鼠酒精性脂肪肝進展中的作用。在酒精性脂肪肝小鼠中，我們首先檢測肝臟膽汁酸含量及相關代謝運輸基因表達水平，發(fā)現(xiàn)模型小鼠肝臟存在膽汁淤積，其膽汁酸含量較對照組顯著增高(33.69±4.144μmoles/g liver vs.14.56±1.02μmoles/g liver, p＜0.001);膽汁酸合成限速酶CYP7A1表達量在酒精組小鼠肝臟中表達亦增高，它的表達受到FXR的負調控，膽汁酸鹽輸

9、出蛋白BSEP的mRNA水平有一定程度降低，該基因受到FXR正調控。在兩組小鼠肝臟內，F(xiàn)XR mRNA以及蛋白質水平并無明顯差別，然而FXR與RXRα結合形成異二聚體的量明顯減少，由于FXR發(fā)揮轉錄活性依賴于與RXRα的相互作用。此外在酒精性肝病小鼠中，F(xiàn)XR的乙?；缴?。FXR乙酰化會抑制其二聚化形成及轉錄活性，故我們推斷在酒精性脂肪肝中FXR活性受到抑制。
　　FXR缺失小鼠喂食酒精性飼料后，血清谷丙轉氨酶活性較野生鼠高(

10、111.01±15.94 IU/L vs.71.48±6.83 IU/L，p＜0.05)，肝臟中甘油三酯含量也比野生鼠高(136.8±10.7 mg/g liver vs.75.02±6.19 mg/g liver, p＜0.001)，肝臟HE染色顯示肝細胞脂肪變性和氣球樣變性比野生多，油紅O染色顯示甘油三含量較野生鼠豐富。相反，給予FXR激動劑WAY-362450處理后，能夠降低血清ALT水平(92.84±9.99 IU/L vs.6

11、0.91±7.18 IU/L，p＜0.05)以及肝臟甘油三酯含量(110.6±7.011mg/g liver vs.57.71±8.08 mg/g liver, p＜0.001)，而FXR缺失小鼠體內給藥WAY-362450并無此效應。肝臟HE染色和油紅O染色均顯示W(wǎng)AY-362450能夠降低野生型小鼠肝臟脂肪變性程度。
　　為了研究FXR治療酒精性脂肪肝的機制，我們首先檢測了酒精代謝相關基因的表達水平，CYP2E1受酒精刺激蛋白

12、表達水平明顯上升，其mRNA水平也明顯上升，若同時給予WAY-362450灌胃治療，小鼠肝臟CYP2E1蛋白和mRNA均明顯下降，酒精代謝引起的脂質過氧化產物TBARS以及4-HNE含量增高也在FXR激活后受到抑制。小鼠原代肝細胞內CYP2E1水平能被FXR激動劑WAY-362450和GW4064抑制。我們的結果首次提出酒精代謝能夠影響肝臟膽汁酸代謝造成膽汁淤積，為酒精性肝損傷的另一可能機制。我們推斷FXR激動劑可以作為治療酒精性脂肪肝