NAMPT對(duì)非酒精性脂肪肝的調(diào)控作用.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明確的損傷肝因素外所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。其包括單純性脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化、肝硬化甚至發(fā)展為肝癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，普通成人NAFLD發(fā)病率為10％～30％，其中10％～20％為NASH，后者10年內(nèi)肝硬化發(fā)生率

2、高達(dá)25％。目前，NAFLD已被認(rèn)為是替代病毒性肝炎成為未來(lái)數(shù)十年引起慢性肝病和肝臟移植的主要因素。NAFLD的發(fā)病機(jī)制最新的理論“多重打擊學(xué)說(shuō)”被廣泛接受，主要指環(huán)境、個(gè)體基因以及腸道微生物等多種因素共同作用引起肝臟的脂肪變、炎癥、氧化應(yīng)激、固有免疫活化等導(dǎo)致肝細(xì)胞的死亡、肝臟的損傷。
　　煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT），是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中一個(gè)重要的

3、輔酶NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，又稱輔酶Ⅰ）的合成限速酶。近年的研究表明，NAD參與了一系列重要生命活動(dòng)，包括:炎癥、胰島素抵抗、肥胖和血脂調(diào)節(jié)。因?yàn)橐阎装Y、胰島素抵抗、肥胖和血脂異常在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，而NAMPT又是這些因素的重要調(diào)節(jié)因子。所以本課題的研究目的利用課題組前期構(gòu)建的酶失活突變體NAMPT轉(zhuǎn)基因小鼠（Dominant-Negative NAMPT transgenic，簡(jiǎn)稱DN-NAMPT小鼠）探

4、討在肝臟組織NAMPT酶活性下調(diào)時(shí)對(duì)NAFLD的調(diào)控作用，為NAFLD的治療提供一些可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和依據(jù)。
　　內(nèi)容：本研究首先通過(guò)免疫印記（Western Blotting）檢測(cè)了NAMPT在肝臟中的表達(dá)情況，然后檢測(cè)了在高脂飼料（High-Fat Diet，HFD）喂食12周誘導(dǎo)的NAFLD模型小鼠的肝臟組織和血清NAMPT的表達(dá)情況。
　　然后分別探討了DN-NAMPT小鼠在標(biāo)準(zhǔn)飲食和高脂飼料（High-Fat Die

5、t，HFD）喂食(NAFLD模型)的病理變化，檢測(cè)了血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，用HE、油紅O、TUNEL染色觀察了肝臟組織的病理學(xué)變化，通過(guò)肝臟組織勻漿測(cè)定了肝臟甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)的含量以及SOD、MDA氧化應(yīng)激的指標(biāo)，利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-time PCR)檢測(cè)了甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry)檢測(cè)了

6、組織巨噬細(xì)胞的侵潤(rùn)和TNF-α、IL-6等炎癥分子的表達(dá)。
　　在研究得到肯定的結(jié)果后，又通過(guò)免疫印記(Western Blotting)、實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-time PCR)、Masson染色和免疫組織化學(xué)測(cè)定了DN-NAMPT小鼠NAFLD模型肝組織的纖維化程度，并用Western Blotting初步探討了NAMPT與NLRP3炎癥小體之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.免疫印記結(jié)果表明NAMPT在肝臟

7、組織的相對(duì)表達(dá)量很高，且在高脂飼料(HFD)誘導(dǎo)的NAFLD模型中，NAMPT在肝臟中有表達(dá)下調(diào)的趨勢(shì)。與之對(duì)應(yīng)NAFLD小鼠肝臟NAD水平也有明顯的下調(diào)。
　　2.在DN-NAMPT轉(zhuǎn)基因小鼠上，DN-NAMPT可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合底物干擾內(nèi)源性NAMPT的表達(dá)和活性，導(dǎo)致DN-NAMPT小鼠肝臟組織的NAMPT與NAD的表達(dá)水平均下調(diào)。
　　3.在給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂食時(shí)，可以看到與WT小鼠相比DN-NAMPT小鼠的肝指數(shù)增大，

8、AST和ALT也有一定的升高，這提示我們DN-NAMPT小鼠出現(xiàn)了一定的肝損傷。同時(shí)，DN-NAMPT小鼠血脂有輕微下降趨勢(shì)，而肝臟的脂質(zhì)蓄積明顯增加，油紅O染色也發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)有脂滴出現(xiàn)。在用Real-time PCR檢測(cè)了甘油三酯和總膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因mRNA后發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)與甘油三酯和總膽固醇外排的相關(guān)基因MTTP、ABCG1、ABCG5、ABCG8和LDL-R表達(dá)下調(diào)。ITT與GTT實(shí)驗(yàn)顯示，DN-MNAMPT小鼠出現(xiàn)了輕微的胰島素抵

9、抗。通過(guò)F4/80、TNF-α的免疫組織化學(xué)表明DN-NAMPT小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)，而IL-6的免疫組織化學(xué)卻無(wú)差異。兩組小鼠均未出現(xiàn)肝纖維化。
　　4.在HFD誘導(dǎo)的NAFLD模型中，DN-NAMPT和WT小鼠的HE與油紅O染色顯示肝細(xì)胞內(nèi)均有大量脂滴出現(xiàn)，兩種小鼠血脂沒(méi)有明顯差異，而DN-NAMPT小鼠肝臟的脂質(zhì)蓄積依舊明顯增加。DN-NAMPT小鼠肝臟的MDA水平增大，而SOD出現(xiàn)下調(diào)。TNF-α的免疫

10、組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)兩種小鼠肝臟均出現(xiàn)了巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng)。但是，DN-NAMPT小鼠的肝組織的炎癥水平（包括通過(guò)TNF-α的免疫組化染色，NLRP3、ASC、caspase-1、IL-18和IL-1β的免疫印記）及凋亡(TUNEL staining)更為嚴(yán)重。通過(guò)Masson染色、α-SMA的免疫印記以及TGF-β、TIMP-1、Pro-Col1α1的Real-time PCR等檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)DN-NAMPT小鼠肝臟的纖維化病變也比WT小