非受體酪氨酸激酶c-Abl調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的機(jī)理研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、非受體酪氨酸激酶c-abl基因位于人的9號染色體上,是Abelson鼠白血病病毒v-abl原癌基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的同源基因,其編碼的蛋白c-Abl通過與多種底物相互作用,在細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞黏附與遷移、氧化應(yīng)激、DNA損傷修復(fù)以及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等生命活動中發(fā)揮重要作用。
   真核生物細(xì)胞骨架由微絲、微管及中間纖維組成,其中,微管主要由α/β-微管蛋白(α/β-tubulin)異二聚體聚合而成,具有高度的動態(tài)性,

2、γ-微管蛋白(γ-tubulin)不是微管組成成分,主要位于微管組織中心(microtubule-organizingcenter,MTOC),與多種其他蛋白形成微管成核復(fù)合物,參與微管的成核。中間纖維分為5種類型,分布于不同種類的細(xì)胞,為每種細(xì)胞提供獨(dú)特的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。三種細(xì)胞骨架各有特點(diǎn)但彼此相互聯(lián)系,共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂、細(xì)胞形態(tài)維持等重要過程。已有研究表明,c-Abl具有肌動蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(G/F-actinbin

3、dingdomain),可與微絲相關(guān)重塑蛋白相互作用進(jìn)而調(diào)節(jié)微絲骨架動態(tài)平衡,在細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移以及偽足形成等過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果提示c-Abl對微管骨架也具有調(diào)節(jié)作用,但其調(diào)控機(jī)理尚不明確。
   本研究首先利用免疫沉淀和免疫印跡方法證實(shí),c-Abl激酶與α/β/γ-tubulin存在相互作用,且與γ-tubulin的相互作用最為顯著,H2O2介導(dǎo)c-Abl激酶活化能顯著增強(qiáng)其與γ-tubulin的相互作

4、用。運(yùn)用原位檢測蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)(Duolink技術(shù))發(fā)現(xiàn),c-Abl與γ-tubullin的相互作用受細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),c-Abl激酶可使α/γ-tubulin酪氨酸磷酸化,且γ-tubulin的酪氨酸磷酸化依賴于c-Abl激酶活性。運(yùn)用細(xì)胞周期同步化方法發(fā)現(xiàn),γ-tubulin酪氨酸磷酸化水平隨細(xì)胞周期改變。利用LC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出γ-tubulin存在5個酪氨酸磷酸化修飾位點(diǎn),即Tyr60、Tyr82、

5、Tyr92、Tyr366及Tyr443。此外,我們還發(fā)現(xiàn)c-Abl可提高γ-tubulin的表達(dá)水平并抑制其泛素化降解,增強(qiáng)γ-tubulin的穩(wěn)定性。
   為了研究c-Abl是否通過γ-tubullin磷酸化修飾調(diào)節(jié)細(xì)胞微管骨架的形成,我們從細(xì)胞中分離了聚合和解離狀態(tài)的α-tubulin,發(fā)現(xiàn)在c-Abl激酶敲低的細(xì)胞中解離態(tài)的微管蛋白所占比例升高,提示c-Abl激酶可抑制微管解聚。同時,利用微管解聚藥物nocodazole

6、處理細(xì)胞,經(jīng)免疫熒光染色觀察微管結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),c-Abl激酶敲低的細(xì)胞對微管解聚藥物敏感性增加,同樣表明c-Abl激酶可抑制微管解聚,穩(wěn)定微管骨架。由于γ-tubulin位于微管組織中心,參與微管成核,因此,我們推測c-Abl激酶對微管細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)作用可能與其對γ-tubulin的磷酸化修飾有關(guān)。
   此外,質(zhì)譜鑒定提示,氧化應(yīng)激可調(diào)節(jié)c-Abl與中間纖維蛋白vimentin及cytokeratin間的相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),

7、c-Abl可使cytokeratin酪氨酸磷酸化。c-Abl可影響vimentin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),當(dāng)c-Abl表達(dá)敲低或激酶活性被抑制,vimentin的表達(dá)均下降。由于vimentin的表達(dá)水平與某些腫瘤細(xì)胞的侵襲能力正相關(guān),且細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)也表明,c-Abl缺失或活性抑制可降低SW480或A549細(xì)胞的侵襲能力,據(jù)此推測該過程可能與c-Abl對vimentin表達(dá)水平的調(diào)節(jié)有關(guān)。
   綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)c-Abl激酶能與微

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