人DC-SIGN轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建及鼠抗人DC-SIGN單克隆抗體的研制.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是免疫系統(tǒng)中最主要的抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresenting cells，APCs)，它具有強(qiáng)大的抗原處理和遞呈能力。由于其分布廣泛，可以第一時間發(fā)現(xiàn)并處理外來抗原并將其遞呈至T細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答或者免疫耐受。DCs功能介導(dǎo)與其表面大量的免疫分子密切相關(guān)。 DC-SIGN屬于II類C型凝集素，由胞內(nèi)段、跨膜段和胞外段組成，分子量為44kDa。胞外段只有一個糖基識別序列(

2、carbohydrate recognition domain，CRD)，識別一些單糖和寡糖。DC-SIGN主要表達(dá)于DCs，是單核細(xì)胞來源的DCs(monocyte-derived dendritic cells，Mo-DC)表面重要的標(biāo)記分子。DCs表面的DC-SIGN與抗原結(jié)合后可以介導(dǎo)抗原的內(nèi)吞，并遞呈至T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，而HIV-1的包膜糖蛋白gp120則可以利用DC-SIGN逃避免疫監(jiān)視，從而有利于HIV-1對T細(xì)胞

3、的感染，此外，DC-SIGN還介導(dǎo)DCs的轉(zhuǎn)運(yùn)并參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。因此構(gòu)建DC-SIGN轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及研制鼠抗人DC-SIGN單克隆抗體不僅在理論研究中具有重要的意義而且在臨床應(yīng)用中具有重要的價值。 本論文分為兩個部分： 1.人DC-SIGN基因克隆及其轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建 從人外周血Mo-DC中抽提總RNA，采用RT-PCR的方法，把總RNA中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并大量擴(kuò)增目的基因。將目的基因裝入pGEZ-Te

4、rm載體中并測序，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將測序正確的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pGEZ-Term/DC-SIGN與兩個輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T，用其培養(yǎng)上清感染L929細(xì)胞，72h后，用Zeocin篩選并最終獲得了穩(wěn)定表達(dá)DC-SIGN分子的L929基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 2.鼠抗人DC-SIGN單克隆抗體的研制及其鑒定 以DC-SIGN轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株L929/DC-SIGN為免疫原，免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，

5、將免疫后小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)，以L929/DC-SIGN細(xì)胞株作為陽性篩選細(xì)胞株，以轉(zhuǎn)pGEZ-Term的L929/mock細(xì)胞作為陰性對照細(xì)胞株，經(jīng)免疫熒光標(biāo)記分析，對抗體分泌陽性孔內(nèi)細(xì)胞的反復(fù)篩選并經(jīng)多次的克隆化培養(yǎng)，最終獲得1株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人DC-SIGN單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為4G8。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)體外連續(xù)傳代(40代)培養(yǎng)，液氮凍存半年后復(fù)蘇，仍生長良好，穩(wěn)定分泌

6、抗體。 采用本室建立的腹水誘生方法生產(chǎn)單克隆抗體，腹水的產(chǎn)量平均為3.5ml/只小鼠。經(jīng)Protein G親和層析柱分離純化抗體，單克隆抗體純化后蛋白含量在4mg/ml之上，免疫熒光法分析表明，其效價在1:1000以上，抗體蛋白用于間接免疫熒光分析的用量為0.2～2μg/l×106細(xì)胞。核型分析結(jié)果顯示，雜交瘤4G8的染色體數(shù)目超過小鼠體細(xì)胞數(shù)目，表明雜交瘤4G8為融合體。 經(jīng)快速定性試紙條鑒定，單克隆抗體4G8的重鏈為

7、IgG1，輕鏈為κ鏈。Westernblot及流式細(xì)胞分析均顯示，單克隆抗體4G8能與DC-SIGN分子特異性結(jié)合。競爭抑制實驗結(jié)果表明，單克隆抗體4G8與商品化抗體E021819識別不同的抗原表位。 流式細(xì)胞分析顯示，DC-SIGN分子特異性高表達(dá)于Mo-DC，并且隨著Mo-DC的成熟表達(dá)水平有一定降低；外周血來源的單核細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞均不表達(dá)DC-SIGN分子；人B淋巴瘤細(xì)胞株Daudi及Raji、人T淋巴瘤細(xì)胞

8、株Jurkat、人白血病細(xì)胞株K562、肺癌細(xì)胞株A549及H1299、人單核來源的IHP-1、U937等腫瘤細(xì)胞株也均不表達(dá)DC-SIGN分子。 流式細(xì)胞技術(shù)分析DC-SIGN分子在單核來源的腫瘤細(xì)胞株THP-1、U937上的誘導(dǎo)表達(dá)情況，結(jié)果顯示，經(jīng)PMA和IL-4聯(lián)合刺激后THP-1細(xì)胞株上有DC-SIGN分子的表達(dá)，并且在刺激48h后達(dá)到了較高水平，刺激72h后表達(dá)水平又有所降低；而U937細(xì)胞株上始終未檢測到DC-SI