DC-SIGN分子配體對肺結(jié)核患者樹突狀細胞黏附BCG能力的影響.pdf

1、目的: DC-SIGN位于樹突狀細胞表面，是近年發(fā)現(xiàn)的與結(jié)核病發(fā)生密切相關(guān)的一個免疫分子，近年體外細胞水平研究結(jié)果顯示結(jié)核菌可通過其胞壁成分ManLAM與DC-SIGN分子結(jié)合，開通下述幾種機制抑制宿主抗結(jié)核免疫應答：抑制未成熟樹突狀細胞成熟；誘導周圍未被感染的樹突狀細胞處于半成熟狀態(tài)；上調(diào)樹突狀細胞表達免疫抑制因子IL-10等。本研究通過探討DC-SIGN分子配體ManLAM對肺結(jié)核患者樹突狀細胞黏附BCG能力的影響，進一步

2、研究DC-SIGN分子在結(jié)核病發(fā)生過程中的作用。 方法: 1.含有EGFP基因的大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體的構(gòu)建 用KpnⅠ和XbaⅠ對質(zhì)粒pEGFP和pHSP70-LA73進行雙酶切，以制備目的基因和載體大片段，用T4連接酶連接，然后轉(zhuǎn)化已制備好的大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，用含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基篩選重組子。 2.綠色熒光蛋白標記BCG 應用eppendorf電轉(zhuǎn)化儀將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入制

3、備好的BCG感受態(tài)細胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，用熱誘導的方法使綠色熒光蛋白表達，從而標記BCG。 3.ManLAM對肺結(jié)核患者樹突狀細胞黏附BCG能力影響的研究 分離研究對象外周血單個核細胞，誘導樹突狀細胞生長，用流式細胞術(shù)檢測其表面DC-SIGN表達率，并在肺結(jié)核患者樹突狀細胞與不同濃度ManLAM預孵育后，再以5：1的比例加入標記BCG共孵育，流式細胞儀檢測樹突狀細胞表面綠色熒光，測定黏附率。 結(jié)果:

4、1.酶切鑒定條帶正確，分枝桿菌穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pHSP70-EGFP。 2.倒置熒光顯微鏡觀察細菌涂片，可見細菌發(fā)出較強的綠色熒光，證明綠色熒光蛋白在BCG中表達，標記BCG成功。 3.肺結(jié)核患者外周血樹突狀細胞表面DC-SIGN表達率為（86.69±3.66）％，明顯高于健康對照組。肺結(jié)核患者外周血樹突狀細胞和標記BCG的黏附率為（89.84±1.57）％，而伴隨著ManLAM濃度的不斷增加，樹突狀細胞和標記B