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文檔簡介
1、目的:機體結(jié)核病免疫主要依賴以T細胞介導(dǎo)的細胞免疫為主。機體對結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)產(chǎn)生細胞免疫必須由抗原提呈細胞(antigenpresenting cell,APC)介導(dǎo)。作為最有效的抗原提呈細胞,樹突狀細胞(dendritic cell,DC)在結(jié)核病免疫中的作用日益受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病患者DC功能有一定程度的缺損,并且當(dāng)MTB感染后DC的成熟標(biāo)記表達水平降低,表明DC的
2、成熟受到MTB的抑制。本實驗通過體外細胞培養(yǎng)的方法對初治結(jié)核病患者DC細胞表面成熟標(biāo)志的表達、細胞因子的分泌、以及對T淋巴細胞的刺激作用等進行研究,探討外周血DC在結(jié)核病發(fā)病機制中的作用,為開發(fā)抗結(jié)核病的免疫治療方法和開發(fā)新型的抗結(jié)核疫苗提供重要的科學(xué)依據(jù)。
方法:
1.收集石家莊市第五醫(yī)院就診的初治結(jié)核病患者58例,根據(jù)《臨床診療指南-結(jié)核病分冊》的診斷標(biāo)準(zhǔn)分為菌陰組30例,菌陽組28例。對照組收集健康體檢者30例
3、。
2.無菌采集初治結(jié)核病患者和健康體檢者外周靜脈血5ml,10U/ml的肝素抗凝,用淋巴細胞分離液經(jīng)密度梯度離心法分離單個核細胞,貼壁3小時后將非黏附細胞洗去,將貼壁細胞在含有rhGM-CSF和rhIL-4的AIM-V培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。分別在第2、4、6天進行半量換液,第7天收集DC。在培養(yǎng)的過程中用倒置顯微鏡觀察細胞的大小、形態(tài)及生長情況,并拍照記錄。
3.用FITC標(biāo)記的CD83和PE標(biāo)記的CD86抗體標(biāo)記各組
4、DC,用流式細胞儀檢測各組DC的表面標(biāo)志CD83和CD86的表達率。
4.以同種異體混合淋巴細胞作為靶細胞,用經(jīng)絲裂霉素C處理過的各組DC作為刺激細胞,用MTT法檢測各組DC促進同種異體T淋巴細胞的增殖能力。
5.采用酶聯(lián)免疫方法(ELISA)檢測各組DC培養(yǎng)上清中及各組血清中的IL-12、IL-10、INF-γ的含量。
6.匯總整理所有數(shù)據(jù),并應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,以P<0.05作為檢驗
5、水準(zhǔn),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,進行兩樣本均數(shù)的t檢驗。
結(jié)果:
1.用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)初治結(jié)核病患者的DC在培養(yǎng)過程中,DC生長密度比正常對照組的密度低,形態(tài)也不及正常對照組的形態(tài)典型。
2.正常對照組、菌陰組和菌陽組CD83的表達量分別為(9.18±6.91)%、(4.10±3.13)%和(2.36±1.31)%;CD86的表達量分別為(92.23±2.62)%、(71.90±12.43)
6、%和(69.33±13.62)%。菌陰組和菌陽組CD83、CD86的表達均顯著低于正常對照組(p<0.001),菌陽組CD83的表達顯著低于菌陰組(p<0.05),而菌陰組與菌陽組CD86的表達差異無顯著性(p>0.05)。
3.混合淋巴細胞增殖實驗的結(jié)果:正常對照組、菌陰組和菌陽組刺激指數(shù)(SI)分別為(5.74±2.20)%、(3.42%±1.25)%和(2.96%±1.27)%。菌陰組和菌陽組均顯著低于正常對照組(p<0
7、.01),而菌陰組與菌陽組比較差異無顯著性(p>0.05)。
4.各組DC培養(yǎng)上清中細胞因子水平變化:正常對照組、菌陰組和菌陽組DC培養(yǎng)上清中IL-12的含量分別為(21.80±8.04) pg/ml、(31.83±16.95)pg/ml和(30.99±14.72) pg/ml,菌陰組和菌陽組均顯著高于正常對照組(p<0.05),而菌陰組與菌陽組比較差異無顯著性(p>0.05);IL-10的含量分別為(4.04±0.80) p
8、g/ml、(4.66±1.45) pg/ml和(4.32±0.88) pg/ml,各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05);IFN-γ的含量分別為(8.28±2.86) pg/ml、9.50±3.26)pg/ml和(9.73±4.56)pg/ml,各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
5.各組血清細胞因子水平變化:正常對照組、菌陰組和菌陽組血清IL-12的含量分別為(55.38±24.93)pg/ml、(39.34±16.9
9、5)pg/ml和(37.01±14.95)pg/ml,菌陰組和菌陽組均顯著低于正常對照組(p<0.01),而菌陰組與菌陽組比較差異無顯著性(p>0.05);血清IL-10的含量分別為(41.33±21.44)pg/ml、(111.01±41.80)pg/ml和(122.27±69.45)pg/ml,菌陰組和菌陽組均顯著高于正常對照組(p<0.001),而菌陰組與菌陽組比較差異無顯著性(p>0.05);血清IFN-γ的含量分別為(27.1
10、2±17.71)pg/ml、(19.08±10.49)pg/ml和(17.67±9.71)pg/ml,菌陰組和菌陽組均顯著低于正常對照組(p<0.05),而菌陰組與菌陽組比較差異無顯著性(p>0.05)。
結(jié)論:
1.初治結(jié)核病患者外周血DC的表面標(biāo)志CD83和CD86的表達量比正常對照組顯著降低,刺激淋巴細胞增殖的能力也顯著降低,提示初治結(jié)核病患者外周血DC的抗原提呈能力下降。
2.初治結(jié)核病患者外周血D
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