結(jié)核患者DC亞群的變化和結(jié)核桿菌抗原對(duì)DC成熟及調(diào)節(jié)γδT細(xì)胞功能的影響.pdf

1、研究背景：已有的研究證明，人體內(nèi)樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）在許多疾病包括肺結(jié)核病中都有不同程度的改變，在不同分期肺結(jié)核患者體內(nèi)DC亞群也呈現(xiàn)不同的變化，這些變化是否與肺結(jié)核患者體內(nèi)γδT細(xì)胞Vδ2％低表達(dá)有相關(guān)性還不得知。已有的研究報(bào)導(dǎo)結(jié)核桿菌對(duì)DC功能有抑制作用，從結(jié)核桿菌H37Ra株提取的結(jié)核桿菌耐熱性多肽抗原（MtbH-Ag）是一種能優(yōu)勢(shì)誘導(dǎo)γδT細(xì)胞活化的小分子多肽；結(jié)核桿菌H37Ra菌體超聲蛋白是成分復(fù)雜

2、的粗抗原，既包括細(xì)菌本身的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)例如細(xì)菌的表面抗原，又包括細(xì)菌的胞漿抗原；分泌蛋白抗原是結(jié)核桿菌H37Ra株分泌性蛋白質(zhì)，由細(xì)菌在生長(zhǎng)期間釋放到細(xì)菌培養(yǎng)液中的抗原。這三種抗原分別對(duì)DC的成熟和功能及對(duì)γδT細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)有何作用卻不清楚，負(fù)載MtbHAg后的DC與體外誘導(dǎo)的自體γδ T細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)后者分泌IL-17和IFN-γ的影響也未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的：（1）觀察PTB與HD和其他疾病間DC亞群即髓樣樹突狀細(xì)胞（myelo

3、id dendritic cells，mDC)和淋巴樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC)的變化及與γδT細(xì)胞Vδ2%低表達(dá)（<60%）的相關(guān)性；
　?。?）觀察MtbH-Ag、菌體超聲蛋白抗原及分泌蛋白抗原對(duì)DC成熟性分化和對(duì)γδT細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的影響；
　?。?）觀察MtbHA-Ag誘導(dǎo)成熟的DC對(duì)自體γδT細(xì)胞分泌IL-17和IFN-γ的影響。方法：（1）采集36例健康者（HD)

4、、138例肺結(jié)核患者、39例矽肺患者和18例間日瘧患者外周靜脈抗凝全血，用四色熒光抗體染色后在流式細(xì)胞儀檢測(cè)和分析DC亞群即mDC(Lin-HLA-DR+CD11c+)和pDC(Lin-HLA-DR+CD123+)，根據(jù)病程進(jìn)展又將肺結(jié)核患者分為初治組和復(fù)治組。
　?。?）用健康成人外周血分離單核細(xì)胞，并在細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4的作用下獲得未成熟DC(immature DC，imDC)；
　　（3）用MtbH-Ag、

5、菌體超聲蛋白抗原及分泌蛋白抗原分別誘導(dǎo)imDC繼續(xù)分化，采用流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理的DC表面成熟性相關(guān)分子CD83、CD86、HLA-DR，非特異性成熟分子 CD69，樹突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞間黏附分子-3結(jié)合非整合素因子（DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin，DC-SIGN）的變化；
　?。?）分離健康成人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，

6、PBMC)，分別在IL-2、MtbH-Ag和或IL-23、IL-1β和TGF-β的作用下體外誘導(dǎo)培養(yǎng)富含效應(yīng)性γδT細(xì)胞的MtbH-Ag激活的T細(xì)胞（Mtb-AT)或富含分泌IL-17的γδT細(xì)胞的MtbH-Ag激活的T細(xì)胞。
　?。?）上述不同抗原誘導(dǎo)后的DC與自體體外誘導(dǎo)的γδ T細(xì)胞（Mtb-AT)按1:20分別共培養(yǎng)2d和6d后，用流式細(xì)胞術(shù)分析自體γδT細(xì)胞分泌IL-17、IFN-γ的比率和γδT細(xì)胞增殖水平（CFSE標(biāo)

7、記法）。
　　結(jié)果：（1）肺結(jié)核（PTB)患者（n=138)的pDC(0.92±0.87)%顯著低于 HD組（n=36)(1.94±0.36)%(p<0.05)，mDC在 PTB組、HD組之間無(wú)差異（p=0.96)， PTB組的mDC/pDC比值也明顯高于HD組（p<0.05)。pDC和mDC的絕對(duì)值計(jì)數(shù)在兩組間均無(wú)差異（p>0.05)。
　?。?）矽肺患者（n=39)的pDC(0.71±0.57)%顯著低于 HD組（n=3

8、6)(1.94±0.36)%(p<0.05)，mDC在矽肺組、HD組之間無(wú)差異（p=0.13），矽肺組的mDC/pDC比值也明顯高于HD組（p<0.05)。pDC和mDC的絕對(duì)值計(jì)數(shù)在兩組間均無(wú)差異（p>0.05)。
　?。?）間日瘧患者（n=18）的pDC(0.34±0.43）%顯著低于HD組（n=36)(1.94±0.36)%(p<0.05)，mDC在間日瘧組、HD組之間無(wú)差異（p>0.05），間日瘧組的mDC/pDC比值也明

9、顯高于HD組（p<0.05)。
　?。?）PTB初治組（n=111)的pDC（0.96±0.11）%顯著低于 HD組（n=36)(1.94±0.36)%(p<0.05)，mDC在兩組間無(wú)差異（p>0.05），PTB初治組的mDC/pDC比值也明顯高于HD組（p<0.05)。
　?。?）PTB復(fù)治組（n=27)的pDC（0.77±0.13）%顯著低于HD組（n=36)(1.94±0.36)%(p<0.05)，mDC在兩組間無(wú)差

10、異（p>0.05），PTB復(fù)治組的mDC/pDC比值也明顯高于HD組（p<0.05)。
　?。?）PTB與矽肺和間日瘧間以及PTB初治組（n=111)和復(fù)治組（n=27)間pDC%、mDC%和mDC/pDC及pDC和mDC的絕對(duì)值計(jì)數(shù)無(wú)明顯差異(p>0.05)。
　　（7）HD、PTB和矽肺（n=213)組γδT細(xì)胞中Vδ2倒置(<60%)病例為27例，其中檢測(cè)DCs亞群的有14例，pDC%、mDC%和mDC/pDC與Vδ2

11、倒置之間的相關(guān)性均R<80%，即無(wú)相關(guān)性。
　　（8）外周血單核細(xì)胞能在GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)下分化為imDC，細(xì)胞具有典型的DC特征性形態(tài)，高表達(dá)CD11c，低表達(dá)CD14；LPS能夠誘導(dǎo)DC成熟，其表面成熟性分子CD83、CD86、HLA-DR、CD69和DC-SIGN的表達(dá)均增加；
　?。?）與誘導(dǎo)前比較：MtbH-Ag誘導(dǎo)的DC表面成熟性分子CD83、CD86、HLA-DR、CD69的表達(dá)均明顯增高(p<0.05

12、，p<0.01，p<0.01，p<0.05)，DC-SIGN表達(dá)無(wú)明顯變化（p>0.05)；菌體超聲蛋白抗原誘導(dǎo)的DC表面成熟性分子HLA-DR、CD69的表達(dá)均明顯增高（p<0.01，p<0.01），CD83、CD86及 DC-SIGN的表達(dá)無(wú)明顯變化（p>0.05）；分泌蛋白抗原誘導(dǎo)的DC表面成熟性分子CD86、HLA-DR、CD69的表達(dá)均明顯增高（p<0.01，p<0.01，p<0.01），CD83和DC-SIGN的表達(dá)無(wú)明顯變

13、化（p>0.05）；
　?。?0）與LPS誘導(dǎo)組比較：MtbH-Ag誘導(dǎo)的DC表面成熟性分子CD83、CD86、HLA-DR、CD69、DC-SIGN的表達(dá)均無(wú)明顯變化；菌體超聲蛋白抗原誘導(dǎo)的DC表面成熟性分子 CD86、CD69的表達(dá)均明顯增高（p<0.05，p<0.05），CD83、HLA-DR、DC-SIGN的表達(dá)無(wú)明顯變化（p>0.05）；分泌蛋白抗原誘導(dǎo)的DC表面成熟性分子CD83、CD86、HLA-DR、CD69的表達(dá)

14、無(wú)明顯變化（p>0.05），DC-SIGN的表達(dá)明顯增高（p<0.01）。
　　（11）負(fù)載MtbH-Ag的DC分別與IL-2誘導(dǎo)的陰性對(duì)照組，MtbH-Ag和IL-2誘導(dǎo)的陽(yáng)性對(duì)照組及MtbH-Ag、IL-2、IL-23、IL-1β和TGF-β聯(lián)合誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)2d后，與陰性對(duì)照組比，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分泌IFN-γ的γδ T細(xì)胞比率均有明顯增高（p<0.01，p<0.05），分泌IL-17的比率無(wú)明顯變化（p>0.05）,

15、但I(xiàn)FN-γ和IL-17在陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間無(wú)明顯變化（p>0.05）。
　?。?2）自體γδ T細(xì)胞（未與負(fù)載MtbH-Ag的DC共培養(yǎng)）的IL-2組（陰性對(duì)照組）、MtbH-Ag組（陽(yáng)性對(duì)照組）和MtbH-Ag+CK組(實(shí)驗(yàn)組）三組，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分泌IFN-γ的γδT細(xì)胞比率均有明顯增高（p<0.05， p<0.05），分泌IL-17的比率無(wú)明顯變化（p>0.05），但I(xiàn)FN-γ和IL-17在陽(yáng)性對(duì)照

16、組和實(shí)驗(yàn)組間無(wú)明顯變化（p>0.05）。
　?。?3）LPS、MtbH-Ag、菌體超聲蛋白抗原和分泌蛋白抗原誘導(dǎo)的成熟 DC分別與γδ T細(xì)胞共培養(yǎng)6d，與未誘導(dǎo)組比較，刺激γδ T細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）均明顯增高（p<0.01）；與LPS誘導(dǎo)組比較，PI在各組間均無(wú)明顯變化（p>0.05）。
　　結(jié)論：（1）與HD組相比，PTB、矽肺患者、間日瘧患者DC亞群中pDC%均明顯降低，而mDC變化不明顯，同時(shí)mDC/pDC的比值也

17、明顯升高。
　?。?）與HD組相比，PTB初治組和復(fù)治組DC亞群中pDC%均明顯降低，而mDC變化不明顯，同時(shí)mDC/pDC的比值也明顯升高。但初治組和復(fù)治組間pDC%、mDC%和mDC/pDC無(wú)變化。
　?。?）pDC%、mDC%和mDC/pDC的變化與γδT細(xì)胞中Vδ2倒置之間無(wú)相關(guān)性。
　?。?）MtbH-Ag能特異性上調(diào)DC成熟性表型的表達(dá)，表明MtbH-Ag具有促進(jìn)DC成熟的作用；菌體超聲蛋白抗原和分泌蛋白抗