不同蛔蟲抗原刺激DC差異性對T細(xì)胞亞群活性的影響.pdf

1、目的:
　　通過用兩種蛔蟲抗原體外刺激樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)，檢測DC表面分子的差異和與之共同培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-10、TNF-α及Foxp3mRNA表達(dá)量變化，以探討兩種蛔蟲抗原刺激DC介導(dǎo)T細(xì)胞亞群活性及其產(chǎn)生的差異，了解不同蛔蟲對宿主寄生特異性的免疫機(jī)制。
　　方法:
　　1、蛔蟲抗原的制備:將人蛔蟲、豬蛔蟲蟲體制成勻漿，經(jīng)20，000rpm離心30min，去除組織糜沉淀，取上

2、清過0.4μm濾膜除菌，用核酸/蛋白分析儀檢測其蛋白濃度，并排除內(nèi)毒素污染后，分裝后置-30℃凍存?zhèn)溆?br>　　2、實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)7個(gè)組，分別為3個(gè)不同濃度的人蛔蟲抗原應(yīng)用液刺激DC組（H1-DC、H2-DC及H3-DC）;3個(gè)不同濃度的豬蛔蟲抗原應(yīng)用液刺激DC組（P1-DC、P2-DC及P3-DC）和僅有DC誘導(dǎo)體系（不含任何抗原）空白對照組(K-DC)。人、豬蛔蟲抗原的3個(gè)梯度濃度都分別為10μg/ml、100μg/ml和20

3、0μg/ml。
　　3、骨髓DC的誘導(dǎo)培養(yǎng):取C57BL/6小鼠的肱骨、脛骨和股骨，用500U/ml雙抗（青霉素和鏈霉素）PBS浸泡清洗后剪斷骺端，用RPMI1640液抽吸將骨髓沖出，將所得細(xì)胞過200目鋼網(wǎng)成單個(gè)細(xì)胞，而后用紅細(xì)胞裂解液處理，洗滌2遍后，用DC誘導(dǎo)體系定容制成細(xì)胞懸液，按3×107/孔接入六孔板，放入37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后，吸棄懸浮細(xì)胞，加入同體系培養(yǎng)液4ml/孔。每天半量換液，第6天收集DC（

4、取一份作為流式細(xì)胞檢測的初始DC來源）。
　　4、蛔蟲抗原刺激DC:將第6天收集懸浮DC細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同濃度蛔蟲抗原培養(yǎng)，細(xì)胞密度為8×104/ml，48小時(shí)后收集懸浮細(xì)胞，即為刺激后DC(H1-DC、H2-DC、H3(-)DC和P1-DC、P2-DC、P3-DC及K-DC)。
　　5、FCM檢測DC表面分子的表達(dá):分別收集初始DC和P1-DC、H1-DC和K-DC，用PBS洗后，用0.3％疊氮鈉溶液重懸，各組加

5、入相應(yīng)量的anti-CD11c PE、anti-CD83 FITC、anti-CD80 PE-Cy5及anti-CD86 PE，混合后4℃避光反應(yīng)半小時(shí)以上，用流式上樣緩沖液清洗后上機(jī)。
　　6、脾淋巴細(xì)胞分離:用淋巴細(xì)胞分離液處理小鼠的脾臟的單細(xì)胞懸液，洗滌2遍后用含10％FBS的RPMI1640調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，接于6孔板(4ml/孔)，放入37℃、5％ CO2環(huán)境中培養(yǎng)4小時(shí)，收集懸浮細(xì)胞備用。
　　7、

6、ELISA檢測細(xì)胞因子:將收集的各組抗原刺激DC及K-DC用25μg/ml絲裂霉素C處理，而后按1∶25的數(shù)量比混合脾淋巴細(xì)胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于24h、48h、72h取1板水平離心(2，000r/min、15min)，收集上清，而后對收集的各組上清，用ELISA法檢測Th1/Th2細(xì)胞因子(TNF-α/IL-10)的表達(dá)。
　　8、熒光定量PCR:取中濃度抗原刺激的DC(H2-DC、P2-DC)和K-DC經(jīng)絲裂霉素C處理后，與

7、脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞按1∶25比例混合培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h收集細(xì)胞，用TRIzol溶解收集，于-30℃保存。按TRIzol一步法抽提總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度。按Invitrogen的M-MLV第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后按SYBGreen試劑盒進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，以cyclophilin-A作為內(nèi)參。反應(yīng)條件為:50℃2min，90℃2min及95℃15s，60℃30s，反應(yīng)50個(gè)循環(huán)。每組標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)

8、孔，以K-DC組第1天的表達(dá)量為對照，計(jì)算Foxp3mRNA的相對表達(dá)量RQ值即2-△△Ct。
　　9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用one-way ANOVA和UNIANOVA分析，結(jié)果用(x)±s表示
　　結(jié)果:
　　1、FCM法檢測DC表面分子的表達(dá):FCM檢測四組DC表面CD11c、CD80、CD86及CD83的表達(dá)水平，分離所得CD11c表達(dá)比例96.93％的DC;兩種蛔蟲抗原都會(huì)影響DC表面

9、活性分子的表達(dá)，相對于K-DC，P1-DC組各分子表達(dá)量都明顯下降，而H1-DC組則有一定程度的升高。
　　2、ELISA檢測Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá):除H3-DC外，各時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組TNF-α的表達(dá)量都低于對照組(K-DC)，且都有顯著性差異(P＜0.05)。低濃度組及高濃度組除24h段與72h段外，各時(shí)間段，相同濃度的兩種抗原刺激組間沒有顯著差異（P＞0.05）。而IL-10在各組的表達(dá)量隨時(shí)間延長而增加;各時(shí)間段的相同濃度除

10、24h外，人蛔蟲抗原組高于豬蛔蟲抗原組(P＜0.05)。
　　3、熒光定量PCR分析Foxp3 mRNA的相對表達(dá)水平:相對于H2-DC組Foxp3mRNA的表達(dá)量，K-DC和P2-DC組各個(gè)時(shí)間段都較低，且都與前者存在差異性(P＜0.05)。H2-DC組的表達(dá)量在短期內(nèi)增加明顯，但又隨時(shí)間而減少。P2-DC組則先增后減，但都與K-DC組間無差異性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、兩種蛔蟲抗原對DC表面分子表達(dá)量