結(jié)核桿菌抗原誘導(dǎo)活化的人γδT細(xì)胞凋亡機(jī)制探討.pdf

1、目的:(1)建立結(jié)核桿菌抗原(Mtb-Ag)再刺激活化的人γδT細(xì)胞凋亡模型;(2)觀察不同濃度乙醇和二甲基亞砜(DMSO)致γδT細(xì)胞和αβT細(xì)胞凋亡及對細(xì)胞活性的影響;(3)探討神經(jīng)酰胺(C2-Cer)誘導(dǎo)γδT細(xì)胞和αβT細(xì)胞凋亡作用的不同之處;(4)應(yīng)用信號分子阻斷劑觀察PI3K,MAPK和PKC等信號傳導(dǎo)途徑在Mtb-Ag再刺激誘導(dǎo)γδT細(xì)胞凋亡中的作用.方法:(1)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞分別用Mtb-Ag和CD3單抗(CD3

2、mAb)刺激并加IL-2培養(yǎng)擴(kuò)增,分別獲得Mtb-Ag激活的T細(xì)胞(MtbAT)(γδT細(xì)胞為主)和CD3mAb激活的T細(xì)胞(CD3AT)(αβT細(xì)胞為主).(2)培養(yǎng)15d~25d的MtbAT用3種濃度Mtb-Ag分別再刺激24h后,應(yīng)用Annexin-V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測γδT細(xì)胞凋亡.(3)MtbAT用Mtb-Ag(10.0 μg/ml)分別再刺激3h、6h、12h、24h后,檢測γδT細(xì)胞凋亡情況.(4

3、)用4種濃度乙醇和DMSO分別作用于MtbAT和CD3AT 4h、24h后,應(yīng)用Annexin-V-FITC/PI染色FCM檢測γδT細(xì)胞和αβT細(xì)胞凋亡,應(yīng)用MTT比色法分析兩類T細(xì)胞活性.(5)用4種濃度C2-Cer分別作用于MtbAT和CD3AT 3h后,檢測γδT細(xì)胞和αβT細(xì)胞凋亡及細(xì)胞活性.(6)MtbAT預(yù)先用LY294002(PI3K途徑抑制劑)、SB203580(p38途徑抑制劑)、Rottlerin(PKC抑制劑)分

4、別處理60min,然后用Mtb-Ag(10.0 μgml)再刺激3h后,檢測γδT細(xì)胞凋亡.結(jié)論:(1)通過用較高濃度Mtb-Ag(10.0μggml)再刺激活化的γδT細(xì)胞3h后,可建立Mtb-Ag再刺激活化的人γδT細(xì)胞凋亡模型.(2)高濃度乙醇和DMSO(5.0％)對γδT細(xì)胞和αβT細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡作用,且對二者活性均有抑制作用.(3)C2-Cer能誘導(dǎo)γδT細(xì)胞和αβT細(xì)胞發(fā)生凋亡,誘導(dǎo)γδT細(xì)胞發(fā)生凋亡所需C2-Cer濃度明