結(jié)核桿菌分泌蛋白ESAT6、CFP10對細(xì)胞凋亡及免疫影響的初步研究.pdf

1、目的:結(jié)核桿菌屬胞內(nèi)寄生菌,比較基因組學(xué)對卡介苗和H37RV進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)所有卡介苗缺失RD1區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)RD1區(qū)存在于所有的致病性結(jié)核分枝桿菌,而結(jié)核桿菌毒力的強(qiáng)弱與細(xì)胞的凋亡成負(fù)相關(guān)。有假說認(rèn)為RD1區(qū)的分泌蛋白ESAT6和CFP10與細(xì)胞的凋亡有關(guān)?？ń槊缡悄壳拔ㄒ粦?yīng)用的結(jié)核病疫苗,但是卡介苗對成人的保護(hù)效果低。本試驗(yàn)對分泌蛋白ESAT6、CFP10與細(xì)胞的凋亡關(guān)系進(jìn)行研究,并用構(gòu)建的ESAT6和CFP10真核表達(dá)載體分別與卡介苗

2、一起免疫小鼠,檢測抗體和IFN-γ的變化,為開發(fā)新的疫苗提供數(shù)據(jù)參考。
　　方法:(1)設(shè)計ESAT6、CFP10基因的引物,以滅活的結(jié)核桿菌H37Rv為模板,用PCR方法擴(kuò)增得到ESAT6、CFP10基因全長。
　　(2)將ESAT6、CFP10基因與T載體連接,構(gòu)建克隆載體pGM18-T-ESAT6、pGM18-T-CFP10;雙酶切克隆載體pGM18-T-ESAT6、pGM18-T-CFP10后,將ESAT6、CFP1

3、0基因分別與pEGFP-N1真核表達(dá)載體連接,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10。
　　(3)用pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果。用Western Blot方法對細(xì)胞蛋白樣進(jìn)行分析。
　　(4)用激光共聚焦顯微鏡對轉(zhuǎn)染的293T和U937細(xì)胞進(jìn)行定位分析。
　　(5)對轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞用流

4、式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡率分析,用熒光實(shí)時定量PCR儀進(jìn)一步對細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因的變化進(jìn)行分析。
　　(6)將pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10重組真核表達(dá)載體分別與卡介苗一起聯(lián)合免疫小鼠,檢測其血清中的抗體及IFN-γ的變化。
　　結(jié)果:(1)質(zhì)粒PCR、雙酶切和測序驗(yàn)證表明pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　(2)pEGFP-N1-ESAT6、p

5、EGFP-N1-CFP10重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達(dá)出綠色熒光,Western Blot結(jié)果表明ESAT6、CFP10在細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)。
　　(3)激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ESAT6后,綠色熒光主要分布于293T細(xì)胞和U937細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì);轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CFP10后,綠色熒光在293T細(xì)胞分布于細(xì)胞質(zhì),而在U937細(xì)胞中綠色熒光除在細(xì)胞質(zhì)分布外,也分布于細(xì)胞核的部分區(qū)域。
　　(4)流

6、式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10組細(xì)胞凋亡率均上升,用熒光實(shí)時定量PCR進(jìn)一步分析表明,兩組細(xì)胞中Caspase8基因的相對表達(dá)量在12h、24h、48h時有顯著上調(diào),Bcl-2基因在48h時相對表達(dá)量有顯著下調(diào),Caspase3基因的相對表達(dá)量在48h時相對表達(dá)量有顯著上調(diào),Bax、AIF基因在12h、24h、48h時相對表達(dá)量變化不顯著。
　　(5)pEGFP-N1-ESAT6

7、、pEGFP-N1-CFP10分別與卡介苗一起免疫小鼠兩次后,結(jié)果表明在小鼠血清中未檢測到針對ESAT6、CFP10蛋白的抗體,但小鼠血清中IFN-γ水平有顯著上升。
　　結(jié)論:(1)獲得了結(jié)核桿菌ESAT6和CFP10基因的重組真核表達(dá)載體pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10。
　　(2)pEGFP-N1-ESAT6、pEGFP-N1-CFP10轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,對細(xì)胞有促凋亡的作用,其促凋亡作用主