檢測結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6分泌蛋白的方法建立和應(yīng)用研究.pdf

1、目前在人類和動(dòng)物的傳染病中，結(jié)核病仍是危害人畜健康的最嚴(yán)重的傳染性疾病。結(jié)核病的診斷技術(shù)主要有細(xì)菌學(xué)，免疫學(xué)和分子生物學(xué)三種診斷方法，其中細(xì)菌學(xué)檢查仍然是結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。但該法涂片陽性率低，細(xì)菌培養(yǎng)費(fèi)時(shí)間；分子生物學(xué)檢查雖然快速，靈敏，但操作煩瑣，技術(shù)要求高，難以廣泛運(yùn)用。免疫學(xué)檢查的診斷價(jià)值雖然不如細(xì)菌學(xué)檢查，但具有簡便，快速，又有一定的敏感性和特異性，因此不失為結(jié)核病有效診斷的輔助方法。近年來，人們對(duì)結(jié)核分枝桿菌(MTB)

2、培養(yǎng)的濾液進(jìn)行了深入的研究，分離出了多種分泌蛋白，如MPT64、PT70、MPT63、MPT53、Ag85、CPF10、ESAT6等。其中的CFP10、ESAT6具有良好的免疫原性，而且為結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌所特有，BCG及非致病分枝桿菌缺乏。因此這兩種蛋白有利于區(qū)別是否是卡介苗接種過的病畜，是許多研究人員所研究的對(duì)象。該研究以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的基因組DNA為模板，經(jīng)重疊PCR擴(kuò)增獲得CFP10-ESAT6融合基因片

3、段，克隆于pET21a表達(dá)載體中，獲得了重組質(zhì)粒pET21a-CFP10-ESAT6，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到了25ku的目的蛋白。Western blot分析重組蛋白的特異性。此后表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化和定量分析后免疫新西蘭大白兔，通過ELISA方法檢測抗體效價(jià)水平，高效價(jià)抗體用DEAE-32陰離子交換柱純化后，一部分抗體為包被所用，另外一部分的抗體用辣根過氧化物酶標(biāo)記后作為檢測用，建立雙抗體夾心法，并將其用于1

4、7種分枝桿菌培養(yǎng)上清和341份臨床血清標(biāo)本的檢測，確定該方法的可行性。 結(jié)果表明：成功構(gòu)建了CFP10-ESAT6融合基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得了CFP10-ESAT6融合蛋白。estern blot分析表明，重組蛋白能與結(jié)核患者血清發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，與健康者血清不發(fā)生反應(yīng)。再以此蛋白免疫動(dòng)物可產(chǎn)生高效價(jià)的抗體?？笴FP10-ESAT6多克隆抗體的效價(jià)在1:16000稀釋后OD<,450>值基本上都達(dá)到1.0左右。在純化和酶

5、標(biāo)記后，分別以1:1000為包被工作濃度，1:3000為酶標(biāo)工作濃度時(shí)，CFP10-ESAT6的最低檢出濃度為25ng/ml，CFP10-ESAT6檢測17種分枝桿菌培養(yǎng)上清只有結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌結(jié)果為陽性。在與血清反應(yīng)時(shí)的敏感性和特異性分別為40.1％，99.2％。 該研究在成功地表達(dá)了CFP10-ESAT6融合蛋白的基礎(chǔ)上，以結(jié)核特異性蛋白免疫兔子獲得高效價(jià)抗體，建立了雙抗體夾心法，該方法對(duì)于結(jié)核桿菌血清學(xué)診斷是切