結(jié)核分枝桿菌CFP10基因密碼子優(yōu)化DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效應(yīng)的評(píng)價(jià).pdf

1、目的：（1）構(gòu)建包含密碼子優(yōu)化CFP10基因的結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o。
　?。?）初步評(píng)價(jià)該疫苗免疫小鼠所誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)。
　　方法：（1）根據(jù)小鼠和人的密碼子使用偏好，使用Gene Optimizer軟件對(duì)結(jié)核分枝桿菌CFP10蛋白的編碼基因進(jìn)行優(yōu)化，但不改變其氨基酸的序列。優(yōu)化后的CFP10基因序列由南京金斯瑞公司進(jìn)行全基因合成并插入真核表達(dá)載體pVAX1，構(gòu)建包含密碼子優(yōu)化 CFP10基因的真核表達(dá)質(zhì)

2、粒 pVAX1/CFP10-o。同時(shí)，從結(jié)核分枝桿菌H37Ra株基因組中，PCR擴(kuò)增天然密碼子CFP10基因，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，純化后的酶切產(chǎn)物CFP10基因與經(jīng)同樣酶切處理的真核表達(dá)載體pVAX1連接，構(gòu)建包含天然密碼子CFP10基因的重組質(zhì)粒pVAX1/CFP10，用酶切及測(cè)序的方法鑒定pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確。（2）以EcoRⅠ和HindⅢ將質(zhì)粒 pVAX1/CFP10

3、進(jìn)行雙酶切獲得 CFP10基因，亞克隆至原核表達(dá)載體pET42a(+)中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET42a/CFP10，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)重組蛋白 CFP10，獲得的蛋白經(jīng) His親和層析柱純化，并采用 SDS-PAGE電泳和western blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒定。純化后的蛋白再通過(guò)去細(xì)菌去內(nèi)毒素試劑盒進(jìn)一步純化去除內(nèi)毒素，并以鱟試驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)毒素去除效果。（3）大量提取經(jīng)鑒定正確的包含密碼子優(yōu)化 CFP10基

4、因的真核表達(dá)質(zhì)粒 pVAX1/CFP10-o及包含天然密碼子CFP10基因的pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒，經(jīng)梭華-SofastTM介導(dǎo)體外轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，并通過(guò)RT-PCR、間接免疫熒光法檢測(cè)重組質(zhì)粒是否能在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；將 pVAX1/CFP10-o和 pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒以肌肉注射輔以體內(nèi)電穿孔的方式體內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠骨骼肌，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。（4）將28只SPF級(jí)BALB/c小鼠分為4組，

5、即pVAX1/CFP10-o組，pVAX1/CFP10組，pVAX1空質(zhì)粒組，NS（生理鹽水）組，分別以pVAX1/CFP10-o、pVAX1/CFP10、pVAX1質(zhì)粒和NS經(jīng)肌肉注射輔以體內(nèi)電穿孔途徑進(jìn)行免疫，每2 w加強(qiáng)免疫一次，共免疫3次。間接ELISA法檢測(cè)初次免疫后0、2、4、6 w小鼠血清中CFP10特異性抗體IgG的水平；ELISA法檢測(cè)末次免疫后2 w（第6 w）小鼠血清中IFN-γ的濃度；ELISPOT法檢測(cè)末次免疫

6、后2 w（第6 w）小鼠脾淋巴細(xì)胞和重組蛋白CFP10共培養(yǎng)后產(chǎn)生IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE標(biāo)記的末次免疫后2 w（第6 w）小鼠T淋巴細(xì)胞經(jīng)重組蛋白CFP10刺激后的增殖動(dòng)力學(xué)變化，用flowjo軟件分析其增殖指數(shù)。
　　結(jié)果：（1）構(gòu)建的pVAX1/CFP10-o和 pVAX1/CFP10重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切電泳鑒定均分別于約3000 bp和300 bp處各見1條帶；測(cè)序結(jié)果顯示插入基因序列均分別與設(shè)計(jì)的C

7、FP10優(yōu)化基因和結(jié)核分枝桿菌H37Rv株CFP10編碼基因序列一致。（2）成功構(gòu)建pET42a/CFP10質(zhì)粒,經(jīng)酶切電泳鑒定分別于約5900 bp和300 bp處各見1條帶；測(cè)序結(jié)果顯示插入基因序列與結(jié)核桿菌H37Rv株CFP10編碼基因序列一致。轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒的BL21（DE3）經(jīng)過(guò)0.1 mmol/L IPTG、37℃誘導(dǎo)6 h，高效表達(dá)了占菌體蛋白總量40％的可溶性融合蛋白，經(jīng)His親和層析柱純化后的相對(duì)分子量約為37 KD的

8、蛋白能與CFP10多克隆抗體發(fā)生特異性的結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)ToxinEraserT M去內(nèi)毒素試劑盒進(jìn)行去除內(nèi)毒素處理后，鱟試劑檢測(cè)蛋白內(nèi)毒素為陰性。（3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核 Hela細(xì)胞后經(jīng) RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示 pVAX1/CFP10-o和 pVAX1/CFP10質(zhì)粒組均得到預(yù)期的目的條帶；間接免疫熒光結(jié)果顯示 pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞均可見特異性綠色熒光，且pVAX1/CFP10-o組熒光強(qiáng)

9、度高于pVAX1/CFP10組，空質(zhì)粒pVAX1組和NS組未見特異性綠色熒光；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠骨骼肌細(xì)胞后免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示 pVAX1/CFP10-o和 pVAX1/CFP10組小鼠肌肉組織內(nèi)均有棕黃色陽(yáng)性顆粒， pVAX1/CFP10-o組多于pVAX1/CFP10組， pVAX1組和NS組未見明顯的棕黃色陽(yáng)性顆粒。（4）pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10組小鼠血清 CFP10特異性 IgG抗體水平檢測(cè)顯示隨免疫次數(shù)的

10、增多呈上升趨勢(shì)，在相同的免疫時(shí)間內(nèi)，pVAX1/CFP10-o組高于pVAX1/CFP10組。末次免疫后2 w（第6 w），兩組IgG抗體水平達(dá)到最高，且pVAX1/CFP10-o組小鼠血清CFP10特異性IgG抗體水平明顯高于pVAX1/CFP10組和pVAX1組及NS組（p﹤0.05），pVAX1/CFP10組高于pVAX1組及NS組（p﹤0.05），而pVAX1組和NS組小鼠血清CFP10特異性IgG抗體水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹥

11、0.05）；pVAX1/CFP10-o組小鼠血清IFN-γ濃度明顯高于pVAX1/CFP10組和pVAX1組及N S組（p﹤0.01），pVAX1/CFP10組小鼠血清IFN-γ濃度高于pVAX1組及N S組（p﹤0.01），而pVAX1組和NS組小鼠血清IFN-γ濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹥0.05）；ELISPOT結(jié)果顯示pVAX1/CFP10-o組斑點(diǎn)數(shù)明顯多于pVAX1/CFP10組和pVAX1組及N S組（p﹤0.01），pVA

12、X1/CFP10組斑點(diǎn)數(shù)多于pVAX1組及NS組（p﹤0.01），而pVAX1組及NS組斑點(diǎn)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹥0.05）；各組T細(xì)胞的增殖指數(shù)檢測(cè)顯示pVAX1/CFP10-o組（2.89±0.39%）明顯高于 pVAX1/CFP10組（2.06±0.16%）（p﹤0.05），pVAX1/CFP10組明顯高于pVAX1組和NS組（p﹤0.05），而pVAX1組和NS組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p﹥0.05）。
　　結(jié)論：

13、　?。?）成功構(gòu)建了包含CFP10基因密碼子優(yōu)化結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10-o和包含CFP10基因天然密碼子的結(jié)核DNA疫苗pVAX1/CFP10。
　?。?）成功高效原核表達(dá)了可溶性CFP10重組蛋白并獲得了無(wú)內(nèi)毒素的純化蛋白。
　?。?）轉(zhuǎn)染pVAX1/CFP10-o和pVAX1/CFP10質(zhì)粒的Hela細(xì)胞和小鼠骨骼肌均可有效表達(dá)CFP10蛋白，且轉(zhuǎn)染pVAX1/CFP10-o質(zhì)粒的Hela細(xì)胞和小鼠骨骼肌表