綠膿桿菌外毒素A基因的密碼子優(yōu)化、脫毒改造及其特性研究.pdf

1、綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A,PEA)是由假單胞菌屬綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的一種細(xì)胞毒性外毒素,是綠膿桿菌重要的致病因子。PEA的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性能使靶細(xì)胞的延伸因子-2(EF-2)發(fā)生核糖基化而失活,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的生物合成受阻,從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。利用PEA的這一毒性作用,將其與靶向蛋白(抗體或靶細(xì)胞膜受體配基)連接或融合制成的免疫

2、毒素被廣泛用于癌癥的靶向治療。PEA除具有上述細(xì)胞毒性作用外,還具有較強(qiáng)的免疫原性,它不僅可作為疫苗蛋白,也是一種重要的疫苗佐劑和疫苗載體。然而由于天然PEA的細(xì)胞毒性較強(qiáng),不能直接作為疫苗佐劑和載體應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn),必須通過(guò)基因工程方法對(duì)其進(jìn)行基因改造使其毒性降低或完全脫毒才能應(yīng)用。
　　 為提高PEA基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平和獲得脫毒的PEA基因,我們首先利用PCR方法從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有PEA基因的pcDNA3.1／P

3、EA質(zhì)粒中擴(kuò)增PEA基因,然后依據(jù)該基因的序列,利用大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子對(duì)PEA編碼基因進(jìn)行了全序列優(yōu)化改造并人工合成,然后利用pET20b(+)質(zhì)粒分別構(gòu)建其與His標(biāo)簽融合的野生型和密碼子優(yōu)化型的PEA原核表達(dá)載體pET20b-PEAwt／t{is和pET20b-PEAopt／His。將表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)使其進(jìn)行分泌表達(dá)。采用硫酸鎂休克的方法從細(xì)菌周質(zhì)中分離表達(dá)的重組PEA蛋白,用N

4、i—NTA瓊脂糖進(jìn)行純化,通過(guò)SDS—PAGE和Western-blot鑒定重組PEA蛋白,用考馬斯亮藍(lán)顯色法檢測(cè)PEA蛋白的濃度,并比較野生型和密碼子優(yōu)化型PEA的表達(dá)水平。然后以構(gòu)建好的pET20b-PEAopt／His質(zhì)粒為模板,根據(jù)PEA蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),在PEA蛋白的氨基酸序列中選定若干位點(diǎn),通過(guò)核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變方法對(duì)選定位點(diǎn)氨基酸的編碼基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,從而得到若干PEA突變體的原核表達(dá)載體。將各種突變體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿

5、菌進(jìn)行表達(dá),用與上述同樣的方法分離純化和鑒定重組PEA蛋白。最后利用小鼠成纖維細(xì)胞L929檢測(cè)不同PEA突變體對(duì)細(xì)胞的毒性作用,從中篩選出毒性低的PEA突變體。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化,PEA編碼基因發(fā)生402個(gè)堿基的取代,GC含量由原來(lái)的69.8％降至52.2％,下降了33.7％。蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,密碼子優(yōu)化型PEA的表達(dá)量(78.7±2.5mg／L)明顯高于未優(yōu)化的表達(dá)量(39.0±2.0mg／L)(P<0.01

6、),表達(dá)水平提高了近1倍。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,密碼子優(yōu)化的PEA基因制備的重組蛋白對(duì)培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞L929有明顯的毒性作用,說(shuō)明該蛋白具有天然生物活性。經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變得到的12個(gè)PEA基因突變體,經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)證實(shí)不同PEA突變體基因均能在大腸桿菌中進(jìn)行分泌表達(dá)。表達(dá)的PEA重組蛋白經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖純化,作用于L929細(xì)胞顯示出不同的細(xì)胞毒性,通過(guò)比較得出12個(gè)低細(xì)胞毒性的PEA突變體,并最終從中選取3個(gè)毒性較低的突變體用于下一