Harpin-,X-蛋白定點(diǎn)突變和密碼子優(yōu)化研究.pdf

1、Harpin蛋白是由植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的畜含甘氨酸、對(duì)熱穩(wěn)定對(duì)蛋白酶K敏感的一類(lèi)蛋白。它在非寄主植物上能夠引起過(guò)敏反應(yīng),而且是植物病原細(xì)菌的一個(gè)重要的致病因子。另外,harpin蛋白還能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生病蟲(chóng)抗性以及提高作物的產(chǎn)量與改善作物品質(zhì)。 確定了一個(gè)來(lái)自于黃單胞菌的harpinX蛋白中的關(guān)鍵的功能區(qū)域,該段區(qū)域抑制harpinX蛋白在大腸桿菌中的蛋白凝集并對(duì)其表達(dá)有重要影響。對(duì)harpinX蛋白的突變研究表明,harpinX蛋

2、白的兩個(gè)主要特征：富含甘氨酸和缺乏半胱氨酸對(duì)激發(fā)HR反應(yīng)和熱穩(wěn)定性并不是必須的。有趣的是,利用生物信息學(xué)手段對(duì)水稻黃單胞harpinX(HpaG,harpinXoo和harpininXooc)蛋白進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)它們含有兩個(gè)保守區(qū),用定點(diǎn)突變技術(shù)缺失了N端的高度親水的保守序列的突變體喪失了過(guò)敏反應(yīng)活性。而這個(gè)含有12個(gè)氨基酸(QGISEKQLDQLL)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)為一個(gè)a-螺旋。進(jìn)一步的研究表明,缺失了該段序列的三個(gè)突變體,在37℃誘

3、導(dǎo)時(shí),其表達(dá)產(chǎn)物都不能在煙草上誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)；而在24℃誘導(dǎo)時(shí),其中兩個(gè)突變體又可以誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng),但表達(dá)水平和野生型相比卻大大下降。SDS-PAGE和Western blot分析發(fā)現(xiàn)HpaG的突變體幾乎完全以包涵體形式存在。這些結(jié)果表明該段序列在harpinX蛋白的折疊和凝集反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用。 利用定點(diǎn)突變分別將HpaG,harpinXoo和harpinXooc的第50,51,53位的亮氨酸替換為脯氨酸,得到了三個(gè)突變體Hp

4、aG(L50P),harpinXoo(L51P)和harpinXooc(L53P)。這三個(gè)點(diǎn)突變的蛋白,即使在10μM的濃度下,在煙草上也不能引起HR反應(yīng)。這一結(jié)果表明,這個(gè)亮氨酸是harpinX蛋白誘導(dǎo)HR活性的關(guān)鍵氨基酸。九個(gè)蛋白突變體噴施處理煙草后觀察其抗病反應(yīng),分析結(jié)果顯示,喪失誘導(dǎo)HR活性的蛋白突變體依然可以誘導(dǎo)抗病性。且HpaG(L50P),harpinXoo(L51P)和harpinXooc(L53P)也可以誘導(dǎo)煙草對(duì)煙草

5、花葉病毒的抗性,而且與野生型相比抗病效果沒(méi)有明顯差別。進(jìn)一步對(duì)三個(gè)突變體蛋白噴施處理煙草后誘導(dǎo)抗病信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,以pET30(a+)空載體表達(dá)產(chǎn)物處理煙草作對(duì)照。結(jié)果顯示,喪失誘導(dǎo)HR活性的蛋白突變體,也可以誘導(dǎo)和抗病信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因的表達(dá)。這提示誘導(dǎo)抗病性與引起HR反應(yīng)之間并沒(méi)有必然的聯(lián)系,HR和SAR可能是兩條信號(hào)通路介導(dǎo)的,或者是在某一上游因子處形成分支。異源蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)的影響因子中,密碼子

6、的偏愛(ài)是一個(gè)較重要的因素。稀有密碼子導(dǎo)致核糖體在和tRNAs結(jié)合時(shí)需要或多或少的氨基酸,當(dāng)某一結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸在表達(dá)時(shí)被消耗過(guò)多,就會(huì)造成轉(zhuǎn)錄錯(cuò)誤?；诖?作者優(yōu)化了hrf2基因并進(jìn)行合成,將優(yōu)化基因連入表達(dá)載體pET(30a+)并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)。但結(jié)果顯示優(yōu)化過(guò)的hrf2syn基因并沒(méi)有獲得高水平表達(dá),而是比原基因的表達(dá)水平略有下降。什么影響了hrf2syn基因的高水平表達(dá)?對(duì)hrf2syn基因的mRNA反轉(zhuǎn)錄PC

7、R和實(shí)時(shí)定量PCR分析表明,tRNA豐度并不是影響基因高水平表達(dá)的必要因素,mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能是主要的影響因子。另外,利用基因的密碼子優(yōu)化是一個(gè)強(qiáng)有力的提高表達(dá)效率的工具,但在優(yōu)化的同時(shí)一定要避免阻礙表達(dá)的特殊的mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成。 用Bulk GST Purification Module和Thrombin Cleavage Capture Kit兩個(gè)試劑盒對(duì)harpinX進(jìn)行了純化。每升誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞可收獲純化har

8、pinX蛋白≥6 mg,純化蛋白的濃度達(dá)到了1.5-2.0 mg/ml。SDS-PAGE分析表明蛋白純度可達(dá)到90-95％經(jīng)過(guò)隨后用脫鹽柱對(duì)harpinX蛋白進(jìn)行了脫鹽。大于5Kda的蛋白分子進(jìn)入柱子空隙,鹽類(lèi)等小分子則被先洗脫下來(lái)。隨后用Pre-Screen Assay篩選蛋白結(jié)晶最優(yōu)的起始濃度。 蛋白可在各種狀態(tài)下形成結(jié)晶,尋找到正確的結(jié)晶條件具有很大的挑戰(zhàn)性。應(yīng)用蛋白結(jié)晶中廣泛采用的懸滴法,即包含有低濃度沉淀劑(比如鹽類(lèi))

9、懸于盛放較高濃度沉淀劑的儲(chǔ)池上面。懸滴和儲(chǔ)池之間進(jìn)行水蒸汽交換濃縮了懸滴濃度。當(dāng)懸滴中的蛋白濃度超出其溶解度時(shí),蛋白就會(huì)沉淀。如果蛋白很純且沉淀過(guò)程很慢,蛋白就有可能結(jié)晶。而在不合適的條件下,蛋白就會(huì)形成不定型固體或凝膠。利用Hampton公司的Crystal Screen Kit我們得到了一些初步的結(jié)果：添加了過(guò)硫酸銨,PEG系列(2000,4000,8000)的組合沉淀劑容易使harpinX蛋白沉淀,對(duì)于沉淀來(lái)講,進(jìn)一步的優(yōu)化可能會(huì)