兩種生防活性蛋白Harpin-,Xooc-和AiiA的表達及生物活性檢測.pdf

1、農藥伴隨人類改造自然、征服自然已有一百多年的歷史，在植物保護中發(fā)揮了巨大的作用，促進了農業(yè)發(fā)展，給人類帶來了巨大的經濟效益。然而使用農藥所引起的副作用，如：病蟲草產生抗藥性、對非靶標生物的直接毒害、對環(huán)境的污染等，已成為了農業(yè)生產上迫切需要解決的問題。二十世紀70年代基因工程技術的出現，為解決這些問題提供了新的途徑與思路。 Harpins是革蘭氏陰性植物病原細菌通過Ⅲ型泌出系統(tǒng)分泌的一類能誘導非寄主植物過敏反應和系統(tǒng)獲得抗性的非

2、特異性蛋白激發(fā)子。本研究采用PCR方法從水稻細菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv．oryzicola，Xooc)RS105菌株中擴增harpin<,Xooc>編碼基因hrf2，將其克隆到酵母表達載體pPICZαA的分泌信號肽基因下游，獲得重組表達質粒pPICZαA-hrf2。重組表達質粒線性化后電擊轉化至畢赤酵母(Pichia pastoris)宿主菌X-33，經抗生素Zeocin篩選和PCR鑒定后，得到重組酵母菌

3、X-33/pPICZαA-hrf2。用甲醇誘導重組酵母菌表達目標蛋白，發(fā)酵上清液經濃縮后進行SDS-PAGE電泳分析，在約18 kD處有特異目標條帶出現。Westem Blot檢測表明表達產物具有良好的抗原性。生物活性檢測表明酵母重組表達蛋白harpin<,xooc>能夠誘導煙草產生過敏反應和促進煙草生長，活性高于在大腸桿菌中表達的harpin<,Xooc>。 aiiA基因編碼的N-酰基高絲氨酸內酯(AHLs)水解酶(AiiA蛋

4、白)能降解細菌產生的AHLs信號分子，干擾該信號分子參與細菌群體感應的調控過程，抑制多種植物病原菌致病基因的誘導表達，從而減輕或消除病原菌的致病性。本實驗根據已報道的aiiA基因序列設計引物，從枯草芽胞桿菌中成功擴增出一段長為753 bp的序列，測序后經blast比對，結果表明與已發(fā)表的aiiA基因序列相似性均在85％以上。將此基因克隆到pET30(a)表達載體中，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經IPTG誘導，超量表達的蛋白在菌體中以