兩種藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌是具有高度多樣性的微生物資源，代謝產(chǎn)物多種多樣，目前被認為是抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲等天然活性物質(zhì)的重要資源。為了尋找更多的生物活性物質(zhì)，本論文采用活性追蹤的方法，研究了4株來源于藥用植物的內(nèi)生真菌的活性代謝產(chǎn)物。內(nèi)容包括：藥用植物（杜仲和無花果）內(nèi)生真菌的分離的初步鑒定；抗菌活性菌株的分級組合篩選；活性菌株的鑒定和發(fā)酵條件考察；活性成分的追蹤分離；單體化合物的結(jié)構(gòu)解析；單體化合物生物活性的初步評價。概括如下:

2、r>　?。?）以杜仲和無花果為研究對象，共獲得了119株內(nèi)生真菌。從杜仲根、莖、葉中分離得到62株內(nèi)生真菌，初步形態(tài)學鑒定，這些內(nèi)生真菌分屬于7目，9科，15屬，其中曲霉屬Aspergillus sp.，鐮孢霉屬Fusrium sp.，鏈格孢屬 Alternaria sp.是杜仲內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群。從無花果根、莖、葉中分離得到57株內(nèi)生真菌，初步形態(tài)學鑒定，分屬于7目，10科，21屬。其中鐮孢霉屬Fusrium sp.，青霉屬Penic

3、illium sp.，曲霉屬Aspergillus sp.是無花果內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種屬。不同部位分離內(nèi)生真菌的數(shù)量、種類和分布不盡相同，這就表明這兩種藥用植物的不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量、分布和種群存在差異。
　　（2）采用抗菌活性篩選為主、代謝產(chǎn)物化學成分篩選為輔的二級組合篩選模式，得到如下結(jié)果：抗菌活性初篩確定活性菌株共有20株（杜仲內(nèi)生真菌11株，無花果內(nèi)生真菌9株），篩選率為16.8％；抗菌活性復(fù)篩篩選到12株高抗菌活性的內(nèi)生真

4、菌，篩選率為10.1%；結(jié)合化學成分復(fù)篩最后確定了ER12、EL09、FR02、FL10這4株具有高抗菌活性，并且代謝產(chǎn)物種類豐富的內(nèi)生真菌作為本論文的研究對象。
　　（3）根據(jù)菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征、18S rDNA以及ITS序列分析結(jié)果，對活性菌株ER12、EL09、FR02和FL10進行菌種鑒定，分別鑒定為刀孢蠟蚧菌、黑曲霉、溜曲霉以及三線鐮孢。以菌絲體生物量、發(fā)酵產(chǎn)物重量、抗菌活性、薄層色譜分析以及高效液相色譜分析為評價依據(jù)

5、，對4株活性內(nèi)生真菌進行了發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性試驗，培養(yǎng)基選擇試驗，發(fā)酵時間試驗，萃取實驗，確定了4株活性內(nèi)生真菌的擴大培養(yǎng)條件以及提取條件。
　?。?）經(jīng)過擴大培養(yǎng)，采用常規(guī)的硅膠柱層析、反相硅膠柱層析，凝膠Sephadex LH-20柱層析、制備薄層層析以及重結(jié)晶等分離手段，從4株活性內(nèi)生真菌分離到90個單體化合物。利用各種現(xiàn)代波譜技術(shù)（EI-MS、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HS

6、QC、HMBC等）并結(jié)合化學方法鑒定了這90個化合物的結(jié)構(gòu)，其中新化合物3個，分別是malformin E（19）、cyclo-(N-methyl-Trp-Leu)（62）和helovlic acid ester（83）。
　　從ER12中分離到34個化合物，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型是12個環(huán)二肽類化合物（3-10，13-16），1個新的環(huán)五肽化合物（19），4個fumiquinazoline生物堿類化合物（17，18，22，23），

7、2個二苯酮類化合物（20，21），1個咪唑類化合物（12），2個甾體化合物（1，2），8個苯的衍生物（11，24-28，31，32）及4個核酸苷（29，30，33，34）。從EL09中分離到18個化合物，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型是9個甾體類化合物（38-44,1,2），3個脂肪酸（35-37），2個呋喃類化合物（45，46），2個多羥基醇化合物（47，48）及2個吲哚類化合物（49，50）。從FR02中分離到22個化合物，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類

8、型是13個吲哚二酮哌嗪類化合物（53-65，其中62為新化合物，65為新天然產(chǎn)物），2個萜類化合物（51，52），2個甾體化合物（1，39），2個多元羧酸（67，68）和1個多元醇（66）。從FL10中分離到33個化合物，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型是7個gliotoxin類化合物（74-80），3個煙曲霉酸的衍生物（81-83），3個環(huán)二肽化合物（13，14，84），5個脂肪酸（69-71，36，37），4個甾體化合物（1，39，72，73）

9、，3個苯的衍生物（87-89），4個堿基或核酸苷（29，30，85，86）及4個多元羧酸或多元醇（47，48，68，90）。
　?。?）采用MIC法，以11種指示菌（4個細菌和7個植物病原真菌）為模型，對4株活性內(nèi)生真菌產(chǎn)生的90個單體化合物進行抑菌活性評價，結(jié)果表明有26個化合物對指示菌顯示了較強的抑制作用。新化合物19（malformin E）和83（helovlic acid ester）對多種指示菌表現(xiàn)了很強的抗菌作用。綜

10、合分析抗菌活性測試的結(jié)果，明確了4株活性內(nèi)生真菌生物活性物質(zhì)的類別，ER12 Lecanicillium psalliotae的活性物質(zhì)主要是fumiquinazoline類生物堿和環(huán)肽類化合物；EL09Aspergillus niger的活性物質(zhì)主要是甾醇類和呋喃類化合物；FR02 Aspergillus tamarii的活性物質(zhì)主要是吲哚二酮哌嗪生物堿類化合物；FL10 Fusarium tricinctumi的活性物質(zhì)主要是gli

11、otoxin類生物堿和煙曲霉酸類化合物。
　　采用MTT法，以3個腫瘤細胞株（MCF-7人乳腺癌細胞、HepG2人肝癌細胞、A549人肺癌細胞）為模型，對分離得到的新化合物和生物堿類代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性進行了初步評價，結(jié)果表明這些化合物對不同腫瘤細胞系表現(xiàn)出不同程度的增殖抑制活性。其中新化合物malformin E（19）MCF-7和HepG2系表現(xiàn)出很好的細胞毒活性，IC50分別是0.65和2.42μM；fumiquinazol

12、ine C（18）和fumiquinazoline J（23）對HepG2和A549腫瘤細胞的增殖有抑制作用，verruculogen（56）對HepG2和A549腫瘤細胞表現(xiàn)出很強的細胞毒性，IC50分別是1.95和2.56μM。
　　總之，本文經(jīng)過篩選獲得4株活性內(nèi)生真菌，通過分離鑒定闡明了4株內(nèi)生真菌中90個化合物的結(jié)構(gòu)，其中包括3個新化合物。評價了這些單體化合物的抗菌活性和抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)了26個單體化合物具有較強抗菌活性