兩種海洋抗菌活性物質(zhì)的重組表達(dá)研究.pdf

1、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是我國對蝦養(yǎng)殖中占絕對優(yōu)勢的優(yōu)良品種。近年來，隨著集約化高密度人工養(yǎng)殖時間的延長，對蝦抗病力逐年降低；又加上環(huán)境污染，使病原菌增多，因而蝦病頻繁暴發(fā)，我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)蒙受了巨大損失。
　　 使用抗生素等藥物防治蝦病害的傳統(tǒng)辦法，已經(jīng)不能從根本上解決所面臨的難題。這是因為，一方面大量抗生素殘留危害人類健康，另一方面，抗生素的濫用導(dǎo)致病原菌耐藥性不斷增強(qiáng)，使水產(chǎn)動物免疫力相對下降

2、。要解決當(dāng)前面臨的困境，除了改善對蝦養(yǎng)殖環(huán)境外，提高對蝦自身免疫力和抵抗力是一條重要途徑。
　　 已有的研究表明，對蝦溶菌酶是重要的非特異性免疫因子之一，在機(jī)體體液免疫過程中起著重要作用。本實驗室已經(jīng)從凡納濱對蝦中克隆得到溶菌酶基因（lvlyz），并進(jìn)行了原核表達(dá)實驗。但是原核重組表達(dá)的凡納濱對蝦溶菌酶蛋白主要以包涵體形式存在，經(jīng)變性和復(fù)性處理后活性仍較差，利用價值很小。鱟素是一類活性極強(qiáng)的廣譜抗菌多肽，本實驗室已經(jīng)合成鱟素基因

3、（tac），并構(gòu)建了藻類表達(dá)載體。
　　 為了獲得活性較強(qiáng)的重組溶菌酶及含有重組鱟素的對蝦餌料，本文分別研究了凡納濱對蝦溶菌酶基因在畢赤酵母（Pichia pastoris）中的重組表達(dá)及鱟素基因在餌料微藻-三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中的重組表達(dá)。本論文主要包括以下三部分研究內(nèi)容：
　　 1.將凡納濱對蝦溶菌酶基因克隆至畢赤酵母分泌型表達(dá)載體 pPIC9K中，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS11

4、5細(xì)胞，經(jīng)組氨酸營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基篩選和PCR檢測獲得轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行連續(xù)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，利用SDS-PAGE和C端攜帶的6×His標(biāo)簽，對發(fā)酵液上清進(jìn)行Western blot檢測，用溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）平板抑菌法檢測表達(dá)產(chǎn)物的抑菌能力。
　　 2.通過比較三角褐指藻對五種抗生素--氯霉素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素、潮霉素和一種除草劑--草丁膦（phosphinothricin，PPT

5、）的敏感性，發(fā)現(xiàn)三角褐指藻對草丁膦非常敏感；進(jìn)一步實驗通過基因槍將草丁膦抗性基因bar導(dǎo)入三角褐指藻，驗證其篩選效果，以期發(fā)展一種更加安全、高效、經(jīng)濟(jì)的三角褐指藻基因工程選擇標(biāo)記。
　　 3.采用基因槍轉(zhuǎn)化法，利用初步建立的以bar基因為選擇標(biāo)記的三角褐指藻遺傳轉(zhuǎn)化體系，將含有抗菌肽鱟素（tachyplesinⅡ）基因（tac）的重組質(zhì)粒pSV-tac/CaMV-bar轉(zhuǎn)入三角褐指藻細(xì)胞中，經(jīng)除草劑草丁膦的篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子，并

6、通過PCR、Southern blotting等手段檢測tac基因，以及檢測轉(zhuǎn)基因藻中的重組鱟素活性。
　　 本論文研究結(jié)果如下：
　　 1.構(gòu)建了含有凡納濱對蝦溶菌酶基因（lvlyz）的畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K/Lvlyz。
　　 2.首次利用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)實現(xiàn)對蝦溶菌酶基因的可溶性表達(dá)，并且表達(dá)產(chǎn)物活性良好。
　　 3.發(fā)現(xiàn)三角褐指藻對草丁膦非常敏感，并測得其72 h半致死濃度為22m