利用Genome shulfling技術(shù)提高海洋鏈霉菌抗菌物質(zhì)活性的研究.pdf

1、海洋中蘊(yùn)藏著大量的微生物資源，在它們中廣泛地分布著抗菌活性菌株，是抗菌物質(zhì)的重要潛在來(lái)源。本課題組從連云港海域潮間帶采集的樣品中篩選得到的1株產(chǎn)廣譜、高活性抗菌物質(zhì)的放線菌。該菌對(duì)5種革蘭氏陽(yáng)性菌、4種革蘭氏陰性菌及18種真菌有顯著拮抗作用。研究表明，該菌在生防、食品及醫(yī)藥方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但野生菌株的產(chǎn)量相對(duì)較低，不能滿足工業(yè)化要求，實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)化學(xué)誘變、抗生素誘變和N離子束注入誘變，該菌株的發(fā)酵產(chǎn)量有了很大的提高，具有潛在的工業(yè)

2、應(yīng)用價(jià)值。
　　 為了進(jìn)一步提高海洋鏈霉菌的發(fā)酵水平，本研究運(yùn)用雙親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，選擇海洋鏈霉菌GB-2經(jīng)不同誘變處理篩選得到的兩株高產(chǎn)菌株streptomycessp.FMBL-42和streptomyces sp.FMBL-43為親本，進(jìn)行了融合研究;并對(duì)穩(wěn)定高產(chǎn)的融合子進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化的研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.確定了菌絲體培養(yǎng)條件。通過(guò)菌絲體在YEME培養(yǎng)和S培養(yǎng)中菌絲生長(zhǎng)量的測(cè)定，結(jié)果顯示，

3、兩親本在YEME培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，菌絲體產(chǎn)量高;在S培養(yǎng)基中，兩親本的生長(zhǎng)量很低，不利于菌絲體的大量生長(zhǎng);FMBL-43和FMBL-42培養(yǎng)基中GLY的添加量分別為0.5％、1.0％，產(chǎn)生的菌絲量合適，且菌絲體較為敏感;FMBL-43和FMBL-42培養(yǎng)基中蔗糖添加量分別為20％、20％，菌絲體生長(zhǎng)量最多，且松散效果最好。
　　 確定了最佳的酶條件及滅活條件。通過(guò)對(duì)菌絲體在不同酶處理后再生數(shù)和再生率的測(cè)定，結(jié)果顯示，蝸牛酶對(duì)兩親

4、本幾乎沒(méi)有破壁效果，溶菌酶破壁率較高;酶濃度的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)MBL-43和FMBL-42合適的溶菌酶添加濃度分別為3mg/mL、4 mg/mL，該條件下，原生質(zhì)體的再生數(shù)再和生率最高;酶解時(shí)間的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)MBL-43和FMBL-42合適的酶解時(shí)間分別為2.0h、1.5h，此時(shí)原生質(zhì)體的再生數(shù)和再生率最高;紫外滅活結(jié)果顯示，在15W紫外照射下，致死率為100％時(shí)，兩親本的滅活時(shí)間均為180min;熱滅活結(jié)果顯示，致死率為100％時(shí)

5、，兩親本的滅活溫度均為100℃，處理5min。
　　 篩選出了穩(wěn)定高產(chǎn)的融合子。通過(guò)初篩、復(fù)篩篩選出了9株高產(chǎn)融合子，分別命名為PF-1、PF-2、PF-3、PF-4、PF-5、PF-6、PF-7、PF-8、PF-9。傳代穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，有5株融合子的發(fā)酵產(chǎn)量高、穩(wěn)定性好，分別為PF-1、PF-2、PF-4、PF-5、PF-6，產(chǎn)量最高的融合子PF-1比親本FMBL-43提高了65.84％。
　　 2、確定了最優(yōu)的發(fā)

6、酵培養(yǎng)基。通過(guò)對(duì)不同碳源篩選，結(jié)果顯示，小麥粉和麥芽浸粉為合適的碳源;通過(guò)對(duì)緩效氮源和速效氮源的篩選，結(jié)果表明，高溫壓榨黃豆餅粉和蛋白胨為合適的氮源;通過(guò)對(duì)無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)的篩選，結(jié)果表明，MgSO4/CaCO3為合適的無(wú)機(jī)鹽離子。
　　 對(duì)培養(yǎng)基組分單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，小麥粉選取20 g/L-40 g/L為后續(xù)部分析因?qū)嶒?yàn)的高、低水平取值范圍;麥芽浸粉選取2.5 g/L-5 g/L為后續(xù)部分析因?qū)嶒?yàn)的高、低水平取值范圍;黃豆餅粉選

7、取20 g/L-40 g/L為后續(xù)部分析因?qū)嶒?yàn)的高、低水平取值范圍;蛋白胨選取1.25 g/L-2.5 g/L為后續(xù)部分析因?qū)嶒?yàn)的高、低水平取值范圍;無(wú)機(jī)鹽離子鈣離子、鎂離子、亞鐵離子、鈷離子合適的取值范圍分別為3 g/L-6 g/L、24 g/L-48g/L、7.5×10-4 g/L-15×10-4 g/L、0.75×10-3 g/L-6×10-3 g/L。
　　 通過(guò)部分因子篩選實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，Streptomyces sp

8、.PF-1培養(yǎng)基的顯著影響因素是黃豆餅粉、小麥粉和硫酸鎂。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃豆餅粉、小麥粉和硫酸鎂的濃度分別為35 g/L、35 g/L、30 g/L時(shí)發(fā)酵產(chǎn)量最高，確定了響應(yīng)曲面的因素水平。
　　 通過(guò)響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果顯示，最適的發(fā)酵條件為黃豆餅粉32.92 g/L，小麥粉36.35 g/L，蛋白胨2.5 g/L，麥芽浸粉2.5 g/L，碳酸鈣6g/L，硫酸鎂30.81 g/L，硫酸亞鐵7.5×10-4g/L，氯化