海洋鏈霉菌鹵化酶基因篩選陽(yáng)性菌株的活性物質(zhì)研究.pdf

1、海洋放線(xiàn)菌可產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣的活性物質(zhì)，是天然活性產(chǎn)物和新藥開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源，因此日益受到人們的關(guān)注。鹵化酶修飾對(duì)多種天然產(chǎn)物的生理學(xué)活性具有重要影響，因此基于鹵化酶的基因篩選有助于快速發(fā)現(xiàn)新的鹵化抗生素，對(duì)新型鹵化酶的催化機(jī)制進(jìn)行研究，有助于利用鹵化酶進(jìn)行活性物質(zhì)的修飾，提高化合物活性。
　　本課題利用基于鹵化酶的基因篩選，從海洋放線(xiàn)菌菌種文庫(kù)中獲得了四株陽(yáng)性菌株，編號(hào)分別為L(zhǎng)131、S077、S104和S187。其中菌

2、株L131和S077的鹵化酶片段氨基酸序列與萬(wàn)古霉素生物合成基因簇中的鹵化酶相似性最高(71％)，對(duì)這兩株菌株的抗菌活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩株菌株都可產(chǎn)生抗真菌活性物質(zhì)，對(duì)白色念珠菌和番茄葉霉菌具有良好的拮抗活性。16S rRNA分析結(jié)果顯示，菌株L131與灰白鏈霉菌（Streptomyces canescens）同源性最高(99％)，但其與灰白鏈霉菌在形態(tài)和生理生化特征方面存在一定差異。L131在Bennett培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落邊緣褶

3、皺，孢子為白色，基內(nèi)產(chǎn)淡黃色色素，不能夠利用阿拉伯糖和果糖作為菌種惟一碳源，且NaCl濃度的耐受范圍為0-110g/L，pH值的耐受范圍為7-11，可能與其更強(qiáng)的海洋環(huán)境適應(yīng)能力有關(guān)。通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化確定了最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米粉15.0 g/L，大豆粉15.0 g/L，酵母浸粉1.5 g/L，CaCO30.5 g/L，甘油0.2％，pH自然），在該培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液具有較好抑制白色念珠菌活性，且活性物質(zhì)能夠在pH5-10的范圍

4、內(nèi)穩(wěn)定，同時(shí)比乙酸乙酯極性大。進(jìn)一步提出了活性物質(zhì)粗提物的純化路線(xiàn):使用AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附離心后的L131發(fā)酵液上清，使用40％甲醇去除未被吸附物質(zhì)，再使用100％甲醇洗脫活性物質(zhì)，粗提物對(duì)白色念珠菌和番茄葉霉菌的最小抑菌濃度均為32.0μg/mL，同時(shí)該活性物質(zhì)能夠造成番茄葉霉菌細(xì)胞膜、孢子損傷和ROS的大量積累。
　　對(duì)星海鏈霉菌S187(Streptomyces xinghaiensis)的鹵化酶SinH功能進(jìn)行了深入

5、研究，氨基酸序列分析顯示，其與替考拉寧生物合成基因簇的鹵化酶StaI和StaK相似性最高(87％)。為獲得可溶的鹵化酶，在大腸桿菌（Escherichia coli) DE3中進(jìn)行了SinH的體外異源表達(dá)，研究了蛋白可溶表達(dá)的條件。pET28a表達(dá)載體得到的為不可溶鹵化酶蛋白，因此構(gòu)建帶有融合標(biāo)簽泛素和自剪切內(nèi)含肽的pHUIE-sinH表達(dá)載體，誘導(dǎo)獲得了可溶的目標(biāo)蛋白，并分離純化獲得目標(biāo)蛋白SinH，但純度較低。構(gòu)建含有鏈霉菌分子伴侶

6、的共表達(dá)體系BL21/pET28a-sinH/pETcoco-pL ISL2，誘導(dǎo)獲得可溶目標(biāo)蛋白，使用Ni-NTA親和層析分離純化獲得目標(biāo)蛋白SinH，構(gòu)建pET28a-fre表達(dá)載體，并誘導(dǎo)表達(dá)分離純化獲得目標(biāo)蛋白黃素還原酶Fre。利用L-Tyr、D-Tyr、L-Trp、D-Trp、4-hydroxy-D-phenylglycine作為底物對(duì)鹵化酶SinH進(jìn)行酶活檢測(cè)均未檢測(cè)到酶活，推斷SinH的底物不是游離氨基酸，其作用于生物合成

7、稍后的步驟。
　　進(jìn)一步利用基因破壞對(duì)鹵化酶SinH的功能進(jìn)行研究，使用λ-Red以及結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法，獲得了sinH的破壞子△sinH,破壞子的抗補(bǔ)體活性與野生型在4d基本一致，在6d、8d時(shí)高于野生型，同時(shí)，△SinH破壞子發(fā)酵液具有更強(qiáng)的抑制金黃色葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌的活性，推斷產(chǎn)生的脫鹵類(lèi)似物具有更強(qiáng)的抗菌活性，與以往的報(bào)道中鹵化提高化合物活性的結(jié)論不一致。通過(guò)HPLC分析發(fā)現(xiàn)野生型S187的出峰時(shí)間為7.842 min的