海洋鏈霉菌鹵化酶基因篩選陽性菌株的活性物質(zhì)研究.pdf

1、海洋放線菌可產(chǎn)生多種結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣的活性物質(zhì)，是天然活性產(chǎn)物和新藥開發(fā)的重要來源，因此日益受到人們的關注。鹵化酶修飾對多種天然產(chǎn)物的生理學活性具有重要影響，因此基于鹵化酶的基因篩選有助于快速發(fā)現(xiàn)新的鹵化抗生素，對新型鹵化酶的催化機制進行研究，有助于利用鹵化酶進行活性物質(zhì)的修飾，提高化合物活性。
　　本課題利用基于鹵化酶的基因篩選，從海洋放線菌菌種文庫中獲得了四株陽性菌株，編號分別為L131、S077、S104和S187。其中菌

2、株L131和S077的鹵化酶片段氨基酸序列與萬古霉素生物合成基因簇中的鹵化酶相似性最高(71％)，對這兩株菌株的抗菌活性進行研究，發(fā)現(xiàn)兩株菌株都可產(chǎn)生抗真菌活性物質(zhì)，對白色念珠菌和番茄葉霉菌具有良好的拮抗活性。16S rRNA分析結(jié)果顯示，菌株L131與灰白鏈霉菌（Streptomyces canescens）同源性最高(99％)，但其與灰白鏈霉菌在形態(tài)和生理生化特征方面存在一定差異。L131在Bennett培養(yǎng)基上生長良好，菌落邊緣褶

3、皺，孢子為白色，基內(nèi)產(chǎn)淡黃色色素，不能夠利用阿拉伯糖和果糖作為菌種惟一碳源，且NaCl濃度的耐受范圍為0-110g/L，pH值的耐受范圍為7-11，可能與其更強的海洋環(huán)境適應能力有關。通過培養(yǎng)基優(yōu)化確定了最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基（玉米粉15.0 g/L，大豆粉15.0 g/L，酵母浸粉1.5 g/L，CaCO30.5 g/L，甘油0.2％，pH自然），在該培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液具有較好抑制白色念珠菌活性，且活性物質(zhì)能夠在pH5-10的范圍

4、內(nèi)穩(wěn)定，同時比乙酸乙酯極性大。進一步提出了活性物質(zhì)粗提物的純化路線:使用AB-8大孔吸附樹脂吸附離心后的L131發(fā)酵液上清，使用40％甲醇去除未被吸附物質(zhì)，再使用100％甲醇洗脫活性物質(zhì)，粗提物對白色念珠菌和番茄葉霉菌的最小抑菌濃度均為32.0μg/mL，同時該活性物質(zhì)能夠造成番茄葉霉菌細胞膜、孢子損傷和ROS的大量積累。
　　對星海鏈霉菌S187(Streptomyces xinghaiensis)的鹵化酶SinH功能進行了深入

5、研究，氨基酸序列分析顯示，其與替考拉寧生物合成基因簇的鹵化酶StaI和StaK相似性最高(87％)。為獲得可溶的鹵化酶，在大腸桿菌（Escherichia coli) DE3中進行了SinH的體外異源表達，研究了蛋白可溶表達的條件。pET28a表達載體得到的為不可溶鹵化酶蛋白，因此構(gòu)建帶有融合標簽泛素和自剪切內(nèi)含肽的pHUIE-sinH表達載體，誘導獲得了可溶的目標蛋白，并分離純化獲得目標蛋白SinH，但純度較低。構(gòu)建含有鏈霉菌分子伴侶

6、的共表達體系BL21/pET28a-sinH/pETcoco-pL ISL2，誘導獲得可溶目標蛋白，使用Ni-NTA親和層析分離純化獲得目標蛋白SinH，構(gòu)建pET28a-fre表達載體，并誘導表達分離純化獲得目標蛋白黃素還原酶Fre。利用L-Tyr、D-Tyr、L-Trp、D-Trp、4-hydroxy-D-phenylglycine作為底物對鹵化酶SinH進行酶活檢測均未檢測到酶活，推斷SinH的底物不是游離氨基酸，其作用于生物合成

7、稍后的步驟。
　　進一步利用基因破壞對鹵化酶SinH的功能進行研究，使用λ-Red以及結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法，獲得了sinH的破壞子△sinH,破壞子的抗補體活性與野生型在4d基本一致，在6d、8d時高于野生型，同時，△SinH破壞子發(fā)酵液具有更強的抑制金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌的活性，推斷產(chǎn)生的脫鹵類似物具有更強的抗菌活性，與以往的報道中鹵化提高化合物活性的結(jié)論不一致。通過HPLC分析發(fā)現(xiàn)野生型S187的出峰時間為7.842 min的