金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的研究.pdf

1、目的：四環(huán)類抗生素最早發(fā)現(xiàn)于20世紀40年代末，是一種很好的快速抑菌劑。其作用機理主要是和細菌30S核糖體的末端結(jié)合，從而阻止肽鏈延伸和細菌蛋白質(zhì)合成。由于其具有廣譜、使用方便、經(jīng)濟等特點，已被開發(fā)為獸用抗生素和飼料添加劑，目前在畜牧業(yè)上得到了廣泛的應(yīng)用。金色鏈霉菌是四環(huán)素工業(yè)生產(chǎn)用菌，為了進一步提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本，其菌種改良成為鏈霉菌工業(yè)的重要攻關(guān)課題之一。多年以來，基于理化誘變和分離篩選的傳統(tǒng)育種方法在鏈霉菌生產(chǎn)菌種的改良方面取

2、得了顯著的成績，但隨著產(chǎn)量水平的提高，傳統(tǒng)方法的局限性越發(fā)明顯。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，已能在基因水平對菌種進行改造，通過導(dǎo)入外源基因，有目的地改造菌種的代謝途徑，實現(xiàn)菌種選育的理性化，甚至產(chǎn)生新的化合物。在基因水平對一個鏈霉菌進行改造的首要的問題就是建立所研究菌株的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。目前，有關(guān)金色鏈霉菌轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的研究國內(nèi)外鮮有報道，而高產(chǎn)工業(yè)生產(chǎn)菌株，由于已經(jīng)過了多輪誘變處理，與野生菌種又有很大不同。本研究探索建立了四環(huán)素工業(yè)生產(chǎn)菌株

3、的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，為進一步利用基因工程技術(shù)對其進行菌種改良奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株原生質(zhì)體的制備和再生； 2.金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株耐藥性調(diào)查，確定篩選標記； 3.PEG-介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化金色鏈霉菌原生質(zhì)體； 4.接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立； 5.電轉(zhuǎn)化； 6.陽性克隆的PCR鑒定分析。 結(jié)果：通過試驗確定了金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株4-6的原生質(zhì)體制備和再生條

4、件：菌絲體培養(yǎng)選擇加2％甘氨酸的S培養(yǎng)基，采用一級培養(yǎng)法，30℃培養(yǎng)20h，收獲菌絲體；制備原生質(zhì)體時，溶菌酶的濃度為2％，酶解溫度控制在35℃，酶解時間為1.5～2.0h；原生質(zhì)體再生選用原固體培養(yǎng)基加0.2mol/L，的蔗糖，平皿要保持干燥，35℃再生培養(yǎng)，再生率最高為16.97％。 嘗試用整合型質(zhì)粒pZMW和穿梭型質(zhì)粒pZM分別轉(zhuǎn)化金色鏈霉菌4-6原生質(zhì)體，均未成功?？疾炝司z培養(yǎng)時間、原生質(zhì)體和質(zhì)粒的濃度、PEG分子量和

5、濃度、緩沖液、抗性選擇時間等因素對轉(zhuǎn)化的影響，也對定位于細胞膜的DNase進行了滅活處理，也都沒有轉(zhuǎn)化成功。說明金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株對外源DNA有很強的限制作用。 接合轉(zhuǎn)移和電轉(zhuǎn)化可以克服某些鏈霉菌的限制修飾系統(tǒng)。但電轉(zhuǎn)化在實驗條件下也是不成功的。 利用大腸桿菌ET12567(PUZ8002)和雙功能質(zhì)粒載體pZMW后，探索了通過接合轉(zhuǎn)移的方法從大腸桿菌向金色鏈霉菌轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的可能性。經(jīng)接合轉(zhuǎn)移操作后的平皿用1ml含有萘

6、啶酸(作用濃度均為50ug/ml)和氨普霉素(作用濃度為30ug/ml)的水溶液覆蓋，再生的菌落經(jīng)PCR鑒定分析，即為陽性克隆。 結(jié)論：金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株對外源DNA有很強的限制作用。常規(guī)的PEG-介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法不能將外源DNA導(dǎo)入該菌體中，盡管電轉(zhuǎn)化法可以克服鏈霉菌的某些限制修飾系統(tǒng)，但在實驗條件下，也不能獲得轉(zhuǎn)化子。本實驗建立了金色鏈霉菌工業(yè)生產(chǎn)菌株經(jīng)濟、快捷的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)--接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。用含有oriT的大腸桿菌