冰城鏈霉菌屬間接轉(zhuǎn)移體系及南昌霉素中斷菌株的構(gòu)建.pdf

1、冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchenggensis)是從中國哈爾濱土壤中分離得到的一種產(chǎn)多種化合物的吸水鏈霉菌，主要產(chǎn)物有聚醚類化合物南昌霉素(nanchangmycin)和大環(huán)內(nèi)酯類化合物米爾貝霉素(milbemycin)。米爾貝霉素是一種十六元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯混合物，具有廣譜、高效的抗寄生蟲活性，在農(nóng)業(yè)害蟲防治中具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。南昌霉素是一種聚醚類混合物，具有較強(qiáng)的殺蟲活性，可被用于雞球蟲病的防治中。冰城鏈霉菌是米爾

2、貝霉素的高產(chǎn)菌株，但由于其發(fā)酵產(chǎn)物多、成分復(fù)雜，這就為米爾貝霉素的純化帶來了困難，所以對其他抗生素的合成進(jìn)行中斷，構(gòu)建米爾貝霉素單一表達(dá)的工程菌株是冰城鏈霉菌工業(yè)化生產(chǎn)的前提條件。外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入鏈霉菌的方法主要有電轉(zhuǎn)化和接合轉(zhuǎn)移。由于大腸桿菌一鏈霉菌屬間結(jié)合轉(zhuǎn)移操作簡單，不要求宿主菌具有原生質(zhì)體制備和再生技術(shù)，并且能有效的避免宿主菌的限制性系統(tǒng)障礙，所以目前被廣泛應(yīng)用。在前期對冰城鏈霉菌屬間接和轉(zhuǎn)移條件的的探索中，采用整合質(zhì)粒pIJ8

3、600作為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒在孢子萌發(fā)的溫度影響、接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基的選擇、接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中MgCl2濃度的選擇、孢子萌發(fā)時(shí)間的選擇、供體和受體比例的選擇及抗生素覆蓋時(shí)間的選擇等方面做出了探索，最后確定冰城鏈霉菌接合轉(zhuǎn)侈效率最高時(shí)的條件為：冰城鏈霉菌孢子在接合轉(zhuǎn)移操作前需要28℃孵育30min；接合轉(zhuǎn)移選擇在含有30mM MgCl2的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行；大腸桿菌與冰城鏈霉菌孢子的供受比為1/10；抗生素覆蓋時(shí)間為20小時(shí)。南昌霉素是一種具有殺蟲活性的聚

4、醚類化合物，其完整的PKS基因簇已于2003年從南昌鏈霉菌(Streptomyces nanchangensis)中克隆得到。本實(shí)驗(yàn)室于2010年完成冰城鏈霉菌的測序工作，得到的南昌霉素PKS基因序列與南昌鏈霉菌中的序列相似性極高。所以可在南昌鏈霉菌的南昌霉素PKS相關(guān)研究基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)冰城鏈霉菌中南昌霉素的中斷表達(dá)。
　　 本研究通過對冰城鏈霉菌基因組序列的生物信息學(xué)分析，確定南昌霉素生物合成基因簇起始模塊的位置。設(shè)計(jì)引

5、物nanloading-L1和nanloading-L2，以冰城鏈霉菌226541的總DNA為模板，擴(kuò)增出loading模塊的左翼序列，與pMD19-T Vector連接構(gòu)建出質(zhì)粒pBC2325；然后在質(zhì)粒中插入卡那霉素抗性基因(neo)構(gòu)建出質(zhì)粒pBC1066；再設(shè)計(jì)引物nanloading-R1和nanloading-R2，擴(kuò)增出loading模塊的右翼序列并與pBC1066連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pBC1797；用HindⅢ和EcoRⅠ酶

6、切并回收連接有neo的長片段，與同樣經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ酶切的pKC1139進(jìn)行連接，構(gòu)建出質(zhì)粒pBC5188，最后對中斷質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。將質(zhì)粒pBC5188從大腸桿菌DH5α中提出并轉(zhuǎn)入ET12567(pUZ8002)，構(gòu)建出用于接合轉(zhuǎn)移的大腸桿菌ET12567(pUZ8002/pBC5188)。利用接合轉(zhuǎn)移方法將質(zhì)粒pBC5188導(dǎo)入冰城鏈霉菌226541，篩選陽性接合子并進(jìn)行鑒定。綜上，本實(shí)驗(yàn)為冰城鏈霉菌工程菌株的構(gòu)建及下