玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63接合轉(zhuǎn)移體系及nsdA基因的研究.pdf

1、玫瑰黃鏈霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分離自馬鈴薯瘡痂病(S.Scabies)自然衰退土壤中的一株拮抗菌。該菌株及其發(fā)酵液對(duì)棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)、瓜類白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea Poll)等多種重要的植物病原菌具有很強(qiáng)的抑制作用，有著良好的生防應(yīng)用潛力。
　　 為了對(duì)玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63中

2、一些功能性基因進(jìn)行研究，對(duì)其進(jìn)行遺傳改造以期得到抗生素高產(chǎn)菌株，本研究建立了該生防菌的接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化體系，并且進(jìn)一步優(yōu)化了接合轉(zhuǎn)移條件，獲得了較好的轉(zhuǎn)化效果。分別以基因整合型質(zhì)粒 pSET152和基因破壞型質(zhì)粒 pKC1139 為出發(fā)質(zhì)粒，ET12567(pUZ8002，pSET152/pKC1139)為供體，玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 孢子和菌絲體為受體，選取 MS、PDA、TSB 瓊脂培養(yǎng)基和燕麥培養(yǎng)基為不同的培養(yǎng)基進(jìn)

3、行接合轉(zhuǎn)移試驗(yàn)。結(jié)果表明 MS 培養(yǎng)基為接合轉(zhuǎn)移的最適培養(yǎng)基，經(jīng)驗(yàn)證，已成功地將質(zhì)粒 pSET152/pKC1139 轉(zhuǎn)入到了玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63中。以孢子為受體時(shí)，孢子預(yù)萌發(fā)條件為50℃熱激10 min,37℃溫育2.5 h，轉(zhuǎn)化效率是10-7～10-6；以菌絲體為受體時(shí)，轉(zhuǎn)化效率是10-7～10-6，但菌絲培養(yǎng)過程中容易受到污染。另外，抗生素的覆蓋時(shí)間對(duì)接合轉(zhuǎn)移效率的影響較明顯，16～18 h 覆蓋效果最好。所

4、以最終選擇轉(zhuǎn)化體系為：玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63 孢子50℃熱激10 min,37℃溫育2.5 h，抗生素覆蓋時(shí)間為17 h。
　　 nsdA(negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是天藍(lán)色鏈霉菌(S.Coelicolor)中發(fā)現(xiàn)的與抗生素合成相關(guān)的負(fù)調(diào)控基因。根據(jù)天藍(lán)色鏈霉菌 A3(2)的序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-6

5、3菌株中的該基因，經(jīng)測(cè)序和序列分析表明，由保守序列引物 nsdA-2R和 nsdA-2L 克隆到的玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63菌株中的該基因 800 bp片段與已知 nsdA基因核苷酸保守區(qū)域序列同源性達(dá)到 99 ％，由全長(zhǎng)序列擴(kuò)增引物 nsdAWZ–R和 nsdAWZ–L 克隆到的該基因包含一個(gè)完整的開放閱讀框，共編碼 369個(gè)氨基酸，與變鉛青鏈霉菌和天藍(lán)色鏈霉菌 A3(2)中的 nsdA基因的核苷酸序列同源性達(dá)到 10

6、0 ％，氨基酸序列同源性達(dá)到 99 ％。該全長(zhǎng)基因命名為 nsdAmgh，并用斑點(diǎn)雜交法驗(yàn)證了 PCR 擴(kuò)增結(jié)果的正確性。
　　 為進(jìn)一步研究該基因在玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63中的功能，利用基因破壞型質(zhì)粒 pKC1139 構(gòu)建了同源重組質(zhì)粒 pSRNA800(pKC1139::800bp nsdAmgh)和 pSRNA2500(pKC1139::1.5 kb nsdAmgh::1.0 kb KmR)來(lái)阻斷該負(fù)調(diào)控

7、基因。將用于基因破壞型重組質(zhì)粒 pSRNA800和 pSRNA2500 轉(zhuǎn)化 ET12567(pUZ8002)獲得接合轉(zhuǎn)移供體菌 ET12567(pUZ8002，pSRNA800/pSRNA2500)，通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63中，均得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子在高溫和抗生素雙重篩選壓力下，玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93-63(pSRNA800)未得到基因中斷突變株，而玫瑰黃鏈霉菌 Men-myco-93