2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、背景:Streptomyces roseosporus NRRL15998是禮來(lái)公司的研究人員從土耳其亞拉臘山的土壤中分離得到的一株產(chǎn)孢放線菌。因其能產(chǎn)生臨床重要抗生素達(dá)托霉素而受到廣泛重視。達(dá)托霉素是新型脂肽類(lèi)抗生素中的一種,經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用于治療復(fù)雜的皮膚和軟組織感染,以及由金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的菌血癥和心內(nèi)膜炎。然而由于S. roseosporus發(fā)酵獲得的達(dá)托霉素產(chǎn)量很低,因此改造玫瑰孢鏈霉菌以提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量至關(guān)重要。

2、r>  擬核結(jié)合蛋白最早在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)確定的鏈霉菌中的擬核結(jié)合蛋白主要包括HupA、HupS、sIHF、Crp、DpsA和DpsC,以及BldD等。這些擬核結(jié)合蛋白在鏈霉菌的發(fā)育分化和次級(jí)代謝產(chǎn)物合成方面發(fā)揮重要功能,例如hupA和hupS敲除突變株孢子中的擬核增大;sihf突變株存在產(chǎn)孢缺陷,十一烷基靈菌紅素(Red)和放線紫紅素(Act)產(chǎn)量提高;dps突變株孢子中的擬核發(fā)生不規(guī)則壓縮;crp突變株的放線紫紅素、十一烷

3、基靈菌紅素和鈣依賴(lài)抗生素(CDA)的產(chǎn)量顯著下降,未知結(jié)構(gòu)的化合物產(chǎn)生;bldD突變株氣生菌絲形成受阻,孢子分化障礙,抗生素產(chǎn)量顯著下降。
  分枝桿菌的擬核結(jié)合蛋白Lsr2,是H-NS樣DNA橋連蛋白,與H-NS相比序列和結(jié)構(gòu)不相似,但其功能相同,可互補(bǔ)hns的突變。Lsr2通過(guò)結(jié)合并橋連DNA,實(shí)現(xiàn)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,壓縮擬核等功能。通過(guò)生物信息學(xué)分析,在S.roseosporus NRRL15998中發(fā)現(xiàn)2個(gè)Lsr2蛋白,但其功能

4、未知。根據(jù)分枝桿菌Lsr2的現(xiàn)有研究,推測(cè)S.roseosporus NRRL15998的Lsr2參與發(fā)育分化和次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成調(diào)控,研究其調(diào)控機(jī)制,可為改造玫瑰孢鏈霉菌提供重要理論依據(jù),為提高已有抗生素產(chǎn)量和激活隱性抗生素生物合成基因簇打下基礎(chǔ)。
  目的:本文旨在探究S.roseosporus NRRL15998中擬核結(jié)合蛋白Lsr2的功能,包括對(duì)S.roseosporus發(fā)育分化和次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的影響,為解析Ls

5、r2在鏈霉菌中的作用機(jī)制和提高已有抗生素產(chǎn)量與激活沉默基因簇提供重要的依據(jù)。
  方法:
  1.生物信息學(xué)分析S.roseosporus NRRL15998的基因組序列,初步確定基因組中與編碼分枝桿菌擬核結(jié)合蛋白Lsr2對(duì)應(yīng)的同源蛋白的基因lsr2和lsr22。
  2.為探究S.roseosporus NRRL15998中Lsr2和Lsr22的功能,構(gòu)建fosmid文庫(kù)。以文庫(kù)質(zhì)粒出發(fā)構(gòu)建敲除載體,進(jìn)而構(gòu)建lsr2

6、和lsr22基因敲除株Δlsr2、Δlsr22和Δlsr2/Δlsr22。以pSET152質(zhì)粒出發(fā),構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體,進(jìn)而構(gòu)建lsr2和lsr22的遺傳互補(bǔ)株(CM)和過(guò)表達(dá)株(OE)。
  3.為探究Lsr2和Lsr22在發(fā)育分化方面的功能,在不同的培養(yǎng)基和不同鹽離子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下,觀察野生型和各突變株的菌絲和孢子的發(fā)育。通過(guò)MIDI脂肪酸檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定敲除株的脂肪酸成分和含量,確定Lsr2對(duì)脂肪酸合成和代謝的影響。
  

7、4.為研究Lsr2和Lsr22對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的影響,發(fā)酵突變株、互補(bǔ)和過(guò)表達(dá)菌株,進(jìn)行藤黃微球菌、銅綠假單胞菌和表皮葡萄球菌的生物活性測(cè)定。再利用半定量RT-PCR檢測(cè)野生型和敲除株基因簇的表達(dá),進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和生物信息學(xué)分析,探究轉(zhuǎn)錄水平變化。
  5.為驗(yàn)證Lsr2和Lsr22的DNA結(jié)合能力,異源表達(dá)蛋白,以基因簇上基因片段為探針,采用EMSA進(jìn)行驗(yàn)證。
  結(jié)果:
  1.確定并成功克隆了分枝桿菌Ls

8、r2對(duì)應(yīng)于S.roseosporus的2個(gè)lsr2基因,分別為lsr2(SSGG_02869)和lsr22(SSGG_03199)。
  2.成功構(gòu)建了S.roseosporus NRRL15998 fosmid文庫(kù),且文庫(kù)遺傳穩(wěn)定性和插入片段隨機(jī)性良好。
  3.利用fosmid文庫(kù)構(gòu)建了lsr2敲除載體pFOSlsr2ko,基于pKC1139構(gòu)建了lsr22敲除載體pKC1139-lsr22,同時(shí)基于pSET152構(gòu)建了

9、lsr2過(guò)表達(dá)載體pSET152Kan-lsr2和lsr22的過(guò)表達(dá)載體pSET152-lsr22。接合轉(zhuǎn)移幾個(gè)載體到野生型中成功獲得了lsr2和lsr22基因敲除株(Δlsr2和Δlsr22)、遺傳互補(bǔ)株(lsr2CM和lsr22CM)、過(guò)表達(dá)株(lsr2OE和lsr22OE)和雙敲除株(Δlsr2/Δlsr22)。
  4.在幾種不同的培養(yǎng)基上培養(yǎng)野生型和單雙敲除株。Δlsr2在本研究中采用的多種培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí),菌絲呈紅色且生

10、長(zhǎng)延遲,產(chǎn)孢受阻。在不加鈉鹽的AS-I培養(yǎng)基中加入0.25M的其他金屬離子后,敲除株的產(chǎn)孢能力有一定程度的恢復(fù)。Δlsr22不管是菌絲發(fā)育還是次級(jí)代謝方面,幾乎沒(méi)有發(fā)生表型變化。但兩個(gè)基因都敲除后,表型改變的程度大于lsr2單敲除。
  5.MIDI脂肪酸檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)了野生型和單雙敲除株菌體的脂肪酸成分及其含量,與野生型相比,敲除株的脂肪酸成分及其含量沒(méi)有顯著變化。
  6.Δlsr2產(chǎn)生的抑制藤黃微球菌的生物活性物質(zhì)減少,

11、但抑制銅綠假單胞菌和表皮葡萄球菌的生物活性物質(zhì)增多。
  7.半定量RT-PCR和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明,在轉(zhuǎn)錄水平上,lsr2缺失株中52%的生物合成基因簇顯著上調(diào)。
  8.體外EMSA實(shí)驗(yàn)中,Lsr22不能結(jié)合DNA,但Lsr2能很好的結(jié)合基因簇FR900098、mureidomycin和collismycin中的SSGG_03174、SSGG_02995、SSGG_02995啟動(dòng)子和SSGG_05697的DNA片段。

12、r>  結(jié)論:
  S.roseosporus NRRL15998基因組中存在兩個(gè)lsr2基因,分別是lsr2(SSGG_02869)和lsr22(SSGG_03199)。其中Lsr2對(duì)S.roseosporus NRRL15998的生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的激活具有重要的影響。lsr2缺失影響了菌絲的發(fā)育和孢子的產(chǎn)生,但不影響脂肪酸的合成和代謝。最重要的是Lsr2負(fù)調(diào)控多個(gè)活性化合物的生物合成基因簇的表達(dá)。Lsr22對(duì)S.ro

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